DNA甲基化与糖尿病肾病的研究进展

陈林娜 张 鹏 王汉民

近年来，随着我国居民生活水平逐步提高、饮食方式的改变和人口老龄化趋势的加剧，糖尿病以及糖尿病肾病的发生率和病死率呈逐年上升趋势，目前糖尿病肾病已成为导致尿毒症的最主要病因之一[1]。糖尿病肾病的发病机制复杂，可能涉及遗传因素、氧化应激、糖代谢异常、血流动力学异常、炎性损伤等多种机制，但以上因素尚不能完全解释糖尿病肾病的发生机制[2]。近年来的研究发现表观遗传变异可能在糖尿病肾病的发生、发展中扮演了关键角色。其中DNA甲基化目前研究较为深入，本文现就DNA甲基化的研究进展及其与糖尿病肾病之间的关系做一综述，以期为糖尿病肾病的临床诊治提供新的理论依据。

一、代谢记忆、表观遗传变异和糖尿病肾病

Zoungas等[3]研究发现，针对2型糖尿病患者，给予强化血糖管理，其益处可以持续到干预停止后的相当长一段时间，存在 “遗赠效应”；而早期暴露于高血糖水平的患者，即使疾病后期接受强化血糖控制，糖尿病导致的微血管并发症仍持续进展，存在 “代谢记忆”现象，而这种“代谢记忆”现象与表观遗传修饰密切相关。表观遗传变异(epigenetic variation)是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化。

表观遗传修饰涉及DNA甲基化、非编码RNA、基因组记忆、基因沉默、组蛋白转录后修饰等，目前DNA甲基化研究较为深入。

二、DNA甲基化与糖尿病肾病

1.启动子区DNA 甲基化与糖尿病肾病有关：DNA甲基化是指通过DNA甲基转移酶(DNA methyltranferase，DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosy-methionine，SAM)作为甲基供体，再将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的过程。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)双核苷酸序列的胞嘧啶上。DNA甲基化可以引起DNA构象、染色体结构、翻译过程发生改变，最终可以在不改变基因组碱基序列的前提下实现对基因表达的调控。CpG的甲基化与否起着十分重要的作用，CpG双核苷酸虽只占人类基因组的10%，但约>80%的CpG双核苷酸处于甲基化状态，未发生甲基化的余下的 CpG 双核苷酸分布在启动子区和第一外显子区。启动子区 DNA 甲基化可以抑制基因的表达，进而影响转录和选择性剪切。此外，启动子区的DNA甲基化还可影响沉默子和增强子等转录活性因子的活性[4]。文利等[5]报道了糖尿病肾病患者中微小RNA(miRNA)中let-7a家族基因启动子区域甲基化水平存在异常，通过检测甲基化位点，发现let-7a-3 启动子区域高度甲基化很可能是糖尿病肾病患者let-7a-3及let-7a低表达的一个重要因素，并促进了糖尿病肾病的发生和发展。还有研究者发现，结缔组织生长因子(CTGF)是推动糖尿病肾病患者肾间质纤维化进程的关键细胞因子。糖尿病肾病患者肾小球CTGF的表达明显升高，与持续高血糖水平降低了CTGF相关基因启动子区 CpG甲基化水平有关[6]。总之，启动子区 DNA 甲基化能通过多种机制导致基因沉默，广泛参与了多种生理过程如细胞周期调控、基因印记、X染色体失活等。

2.糖尿病肾病患者全基因组甲基化整体水平明显增加：Maghbooli等[7]通过反向高效液相色谱法(RP-HPLC)研究发现，糖尿病肾病患者相比于单纯糖尿病患者的基因组整体甲基化水平明显升高。近年来还有研究发现糖尿病患者基因组异常的DNA 甲基化修饰可使胰岛素相关基因的表达、信号转导发生改变，从而影响整个疾病进程。有研究对单纯糖尿病与糖尿病肾病患者全基因组的甲基化水平进行了比较，两组患者的基因组甲基化水平呈现出显著性差异，其中单纯糖尿病患者的基因甲基化程度相对较低，提示 DNA甲基化可能与糖尿病肾病的发病机制有关[8]。此外，王晓楠等[9]利用全基因组甲基化测序进一步证实了DNA甲基化与糖尿病肾病的关系密切。实验收集了糖尿病肾病患者、糖尿病非肾病患者和正常人肾脏组织标本进行检测，结果显示，糖尿病肾病患者全基因组CpG 甲基化水平明显高于其他两组患者，进一步对3组患者差异甲基化区域(DMR)数关联到的差异基因进行差异基因功能分类注释(GO)分析和差异基因生物学路径(KEGG)分析，整合素相关差异基因(FOXC1、ITGA8、MYLK3、FGF9、COL4A3、FLT1、MYC)等62个基因甲基化水平与表达水平呈负相关，并通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路发挥作用。以上表明了DNA甲基化可能在糖尿病肾病的发生、发展中起着关键作用。

3.DNA甲基化与炎性损伤:有研究发现,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)等炎性因子启动子区的甲基化水平与其表达水平呈负相关，IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-10、IL-11启动子区的低甲基化可以上调上述炎性因子的表达水平，从而促进炎性反应的发生或提高炎性水平；有些炎性因子可以增加DNA甲基化转移酶的活性，进而引起DNA异常甲基化。Bomsztyk等[10]更进一步研究证实，糖尿病肾病患者的IL-1β、TNF-α 和IL-17启动子的区低甲基化可能直接与肾组织炎性水平有关。还有研究认为，糖尿病肾病患者中，促炎转录因子(NF-κB)活性增加，而表观遗传修饰对高糖诱导的NF-κB的激活、糖尿病并发症相关炎性基因在血管细胞和单核细胞中的表达均有作用。此外，叉形头转录因子3(FOXP3)是促进调节性T细胞(Treg)成熟和调节其功能的重要因子，在维持机体免疫耐受和免疫抑制中扮演了关键角色。Fontenot等[11]研究发现，FOXP3基因过度甲基化可能是糖尿病肾病免疫失调的重要原因之一，FOXP3基因启动子区的高度甲基化可以下调FOXP3蛋白的表达，继而削弱了Treg细胞的免疫抑制功能，加剧了糖尿病肾病患者的免疫失调和炎性损伤。上述研究表明DNA甲基化与糖尿病肾病的炎性损伤有密切关系。

4.DNA甲基化与氧化应激：持续高血糖和TGF表达水平升高均可导致过氧化应激，从而损伤肾小球和肾小管细胞，糖代谢紊乱还可使机体维生素C、维生素E和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化剂水平下降，削弱了机体抗氧化能力。此外，氧化应激还可上调一系列炎性细胞因子的表达，提高机体炎性水平，而炎性反应水平的升高也会反过来刺激氧化应激水平进一步增加，形成恶性循环[12]。凝固酶活性蛋白C可通过抗氧化作用而起到降低肾组织氧化应激损伤的作用，原癌基因shc编码的蛋白(p66shc蛋白)其水平升高可加剧高血糖所致的细胞损害，Shahzad等[13]研究发现，凝固酶活性蛋白C水平下降可使p66shc基因启动子区甲基化水平下降并使p66shc蛋白表达上调，提示凝固酶活性蛋白C可能调节p66shc基因甲基化水平，从而影响糖尿病肾病的发生和发展。Swan等[14]比较了单纯1型糖尿病患者与糖尿病肾病患者的基因组跨越450K和27K甲基化序列，结果发现两组患者线粒体功能相关基因(PMPCB、TSFM、AUH)的甲基化水平差异显著，而线粒体应激、内质网应激与糖尿病肾病的发生、发展有一定关系，表明基因甲基化异常与1型糖尿病肾病密切相关。但总体而言，关于DNA甲基化与氧化应激损伤在糖尿病肾病中关系的研究报道尚不多见，二者的联系需要更多的研究进一步证实。

5.DNA甲基化与肾脏纤维化：糖尿病肾病主要病理改变表现为肾小球基膜增厚、肾小管间质纤维化、细胞外基质蛋白沉积增多、系膜扩张，最终导致肾小球完全硬化[15]。有研究者发现，糖尿病肾病、慢性肾衰竭患者肾小管细胞全基因组DNA中纤维化相关基因甲基化水平与正常人比较差异显著，提示DNA甲基化在肾脏组织纤维化过程中扮演了重要角色[16]。研究证实，持续的高血糖水平可诱导肾脏固有细胞内转化生长因子-β1(TGF-β1)表达上调，病理条件下，TGF-β1 可诱导多种细胞表型转化和异常增殖，趋化成纤维细胞和单核细胞，继而增加细胞外基质蛋白的沉积，促进纤维化进程[17]。多项研究发现，TGF-β1 基因低甲基化水平是 TGF-β1 蛋白高表达的分子基础，TGF-β1 基因调控区存在一个横跨启动子及第一外显子区的 CpG序列，而对该CpG序列的甲基化修饰主要发生于第一外显子区。张倩等[18]研究证实，糖尿病肾病患者TGF-β1第一外显子区甲基化水平较健康人群和单纯糖尿病患者显著下降，这种DNA甲基化水平的异常下降与TGF-β1的过度表达存在一定的因果关系，并最终参与了肾脏纤维化过程。调控蛋白水解活性与细胞外基质蛋白沉淀的酶系(NMMPs)通过降解肾细胞外基质中胶原和非胶原成分而对肾细胞外基质沉淀-降解的动态平衡发挥调控作用。冯诗雅[19]研究发现，糖尿病肾病患者的基质金属蛋白酶家族相关基因(MMP-9)启动子区甲基化水平明显降低，而MMP-9的表达水平则显著升高，且患者的MMP-9启动子区去甲基化程度与其肾病病程呈正相关，并与肾小球滤过率(GFR)呈负相关，上述研究结果证明MMP-9启动子区甲基化促进了MMP-9蛋白的表达，从而推动了糖尿病肾病患者肾脏纤维化进程。上述研究表明，DNA甲基化可能与糖尿病肾病的肾脏纤维化密切相关。

6.DNA甲基化与细胞凋亡：肾小管上皮细胞、肾小球固有细胞、足细胞凋亡均属于糖尿病肾病的重要特征，并参与了糖尿病肾病的发病及进展。肾病相关基因(UNC13B基因)介导了高血糖水平下肾小球固有细胞的凋亡，有研究证实，1型糖尿病肾病患者UNC13B基因启动子CpG岛的甲基化水平出现了异常降低，同时观察到UNC13B呈高表达，由此推测，UNC13B基因的甲基化异常可能促进了肾小球细胞的凋亡，从而参与了糖尿病肾病的发病与进展[20]。

7.DNA甲基化与非编码RNA：非编码RNA(ncRNA)是指不被翻译成蛋白质的一类功能性RNA，可粗略分成两类：(1)短链ncRNA：主要为微小RNA(miRNA)，其他的有Piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)、小干扰RNA(siRNA)等。(2)长链ncRNA(lncRNA)。 miRNA是一类长度约21～23个核苷酸的非编码小RNA，它参与多种疾病的进程，其中包括糖尿病肾病的发生和发展。Gondaliya等[21]利用肾近端小管上皮细胞模拟建立了体外糖尿病肾病微环境的模型证实了miR29b可以靶向结合DNA甲基转移酶(DNMT)。在高糖条件下，miR29b的表达下调，使得DNA甲基化特异性标志物(DNMT3A、DNMT3B、DNMT1)的表达水平提高，提示miR29b与糖尿病肾病发病机制中的DNA甲基化存在相关性。研究还进一步证实了miR29b可以显著抑制糖尿病肾病中肾近端小管上皮细胞的肾损伤，具有一定的肾脏保护作用。此外，还有研究发现，在妊娠期糖尿病肾病患者胎盘组织中miR-98基因表达上调或下调后，DNA甲基化的水平随后也发生了相关性的变化，通过进一步原位杂交检测、定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹实验以及免疫组化检测等验证了miR-98可结合甲基cpG结合蛋白2(MeCP2)的3′-非翻译区 (UTR)来抑制Mecp2的表达，从而使与葡萄糖摄取相关的基因TrPC3表达失调[22]。

综上所述，DNA甲基化与糖尿病肾病的发病密切相关，现已证实DNA甲基化与糖尿病肾病发病过程中炎性损伤、氧化应激、肾脏纤维化、细胞凋亡、非编码RNA等机制有关，对DNA甲基化的进一步研究有助于加深对于糖尿病肾病发病机制的理解。此外，由于表观遗传学修饰具有可逆性，DNA甲基化的相关研究为糖尿病肾病的防治提供了新的思路，有利于提高糖尿病肾病的临床诊治水平。