超声引导下细针穿刺联合FAM172A在甲状腺乳头状癌诊断中的应用价值

许培培 李梅芳 李连喜 郭明高

近年来，甲状腺癌在全世界的发生率持续上升，其中最常见的类型为乳头状癌，约占所有类型的80%～90%[1]。超声引导下细针穿刺(ultrasound-guided fine needle aspiration，US-FNA)是诊断甲状腺结节的重要手段[2]。目前，超声检查已经成为甲状腺癌早期诊断的重要方法。研究表明，超声检查的甲状腺结节中，90%甲状腺结节为良性，但对于恶性甲状腺结节，超声诊断的准确性仍需提高[3]。分子诊断的不断发展，使发现早期恶性肿瘤成为可能[4]。

FAM172A 基因又名 C5orf21 基因，是一个结构和功能尚未明确的新基因[5]。本课题组从主动脉组织中克隆出了该基因，并初步研究了甲状腺乳头状癌的影响，发现FAM172A在甲状腺乳头状癌组织中高表达，并促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖[6]。本研究旨在通过免疫组化和US-FNA，进一步探索FAM172A蛋白在甲状腺乳头状癌中的诊断价值。

资料与方法

1.研究对象：(1)回顾性选取2017年1月～2018年1月在上海交通大学附属第六人民医院外科进行手术治疗的甲状腺肿瘤患者的石蜡切片样本共70例，其中50例为甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer, PTC)，20例为甲状腺腺瘤(follicular thyroid adenoma, FTA)。(2)前瞻性纳入2018年1～6月在上海交通大学附属第六人民医院进行超声检查怀疑甲状腺肿瘤的20例患者，通过FNA获得细胞样本。纳入标准：①超声和临床表现可疑甲状腺滤泡性肿瘤; ②原发性甲状腺肿瘤患者，之前未接受过甲状腺手术；③根据超声检查，甲状腺结节>1cm；④患者自愿进行FNA检查并签署知情同意书。排除标准如下：①原因不明的出血病史; ②出血倾向(活化部分凝血活酶时间高于正常上限10s，凝血酶原时间高于正常上限3～5s，纤维蛋白原<1g/L，血小板计数<50000/mm3且聚集功能差，经临床会诊不能进行穿刺活检)；③近期应用抗凝血药物；④严重高血压(收缩压>180mmHg,1mmHg=0.133kPa)者；⑤超声引导下不能确定活检的合适部位。

2.方法：(1)常规免疫组化：将石蜡切片脱蜡至水。3% H2O2室温孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，10%正常山羊血清封闭，室温孵育10min，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃ 孵育1h。PBS 冲洗5min，重复3次。滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃ 孵育30min。PBS冲洗5min，重复3次。滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育30min。PBS冲洗5min，重复3次。DAB显色剂显色15min。自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。(2)US- FNA：患者仰卧位，充分暴露颈前区。对暴露区域进行消毒，铺巾。局部麻醉后，在超声引导下进行穿刺，重复穿刺3～5次，吸出细胞样本涂到玻璃片，涂3～4张，然后将涂片放到95%乙醇槽中固定。术后对穿刺点按压10min止血。(3)细胞免疫组化：通过FNA穿刺取得细胞涂片样本，经95%乙醇固定后，后续操作步骤同常规免疫组化。(4)FAM172A评分：染色结果由1位病理学工作者进行评估。具体方法如下，首先计算染色评分，在每张片子上随机选取3～5个高倍视野，若细胞质或细胞核出现棕黄色则为阳性细胞。根据阳性细胞面积所占的百分比来进行评分：阳性面积≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。同时根据染色强度进行评分：0分为无染色，1分为淡黄色，2分为黄色，3分为棕黄色。然后将上述染色评分和染色强度评分相乘所得的结果作为最终的评定标准。

3.统计学方法：采用GraphPad Prism 5.0统计学软件对所有数据进行统计分析和处理，采用t检验比较组间数据，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.回顾性分析FAM172A免疫组化鉴别乳头状癌：对50例PTC和20例FTA石蜡组织进行免疫组化。结果发现FAM172A蛋白在PTC组织中的表达显著高于FTA中的表达(图1)。同样，FAM172A的染色得分在PTC中显著高于FTA(图2)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 FAM172A在甲状腺腺瘤和乳头状癌中的表达(免疫组化染色，×200)A.甲状腺乳头状癌；B.甲状腺腺瘤

图2 FAM172A免疫组化评分

2.ROC曲线分析FAM172A最佳截点：基于FAM172A的免疫组化染色评分，绘制ROC曲线，得出FAM172A评分为3.5是鉴别良、恶性甲状腺滤泡性肿瘤的最佳临界点，具有92%的敏感度和60%的特异性，曲线下面积为0.849(图3)。

图3 FAM172A细胞免疫组化诊断甲状腺乳头状癌的ROC曲线

3.前瞻性分析FAM172A细胞免疫组化鉴别甲状腺乳头状癌：对20例疑为甲状腺肿瘤患者进行超声引导下FNA获得细胞样品，进行FAM172A的细胞免疫组化。根据术后病理结果，20例FNA样本中有5例PTC和 20例FTA。FAM172A在PTC和FA中表达的代表性的免疫组化结果见图4。免疫组化结果显示FAM172A的表达在PTC中显著高于FTA。

图4 FAM172A细胞免疫组化在甲状腺乳头状癌和腺瘤中的表达(免疫组化染色，×400)A.甲状腺乳头状癌；B.甲状腺腺瘤

4.FAM172A在甲状腺肿瘤中免疫组化良恶性判定结果：FAM172A的免疫组化良、恶性判定结果见表1。FAM172A的免疫组化评分≥3.5被认为是PTC。根据免疫组化评分标准，5例PTC患者全部判定为阳性，15例FTA患者中有12例判定为阴性。最终FAM172A鉴别恶性和良性甲状腺肿瘤的敏感度为100%，特异性为80%。

表1 FAM172A细胞免疫组化与术后病理比较 (n)

讨 论

由于诊断技术的进步和各种环境因素的影响，全球甲状腺癌的发生率明显上升。有研究表明，我国的甲状腺癌发生率显著增加，年均增长率高达20.1%，主要类型为PTC[7, 8]。目前，超声引导下FNAC是诊断甲状腺乳头状癌的重要诊断方法，有着较高的敏感度和特异性，但由于细胞学的局限性，仍有10%～40%很难明确其性质。随着分子标志物的不断发展，越来越多的分子标志物应用到临床诊断中[9～16]。

本研究发现，FAM172A在甲状腺乳头状癌中高表达，并促进甲状腺癌细胞的增殖[6]。FAM172A 在不同的肿瘤中可能发挥着不同的作用。本研究发现，超声引导下FNAC联合FAM172A细胞免疫组化有助于甲状腺乳头状癌的诊断，其敏感度为100%，特异性为80%。有研究报道，US-FNA诊断甲状腺乳头状癌的敏感度和准确性分别为70.7%和74.4%。进一步联合BRAFV600E可提高甲状腺乳头状癌诊断的敏感度(86.2% vs 70.7%)和准确性(87.9% vs 74.4%)[17]。另有研究结果表明，US-FNA诊断甲状腺乳头状癌的敏感度为78.6%(33/42)，特异性为71.4%(20/28)，ROC曲线下面积为0.750。US-FNA联合CK19和Ki-67，ROC曲线下面积可提高到0.858，联合CK19和Ki-67检测相比于单独US-FNA具有更好的诊断价值[10]。与之前研究比较，FAM172A作为蛋白标志物有着更高的敏感度和特异性。

综上所述，FAM172A作为一种新型蛋白分子标志物，能够为PTC患者的确诊提供参考，提高PTC诊断的准确性。但仍需开展更多的前瞻性、大样本研究去验证。