一种荧光细胞标准计数样片的制备与应用

邢国杰，梅胜兰，相鸿坤

上海柏慧康生物科技有限公司，上海 201203

引言

癌症是当今社会导致人类死亡的重要元凶之一，严重威胁着人类的生命健康，癌症患者的主要死亡原因是肿瘤的复发和转移[1-3]。而循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）则是癌症转移的直接原因[4-5]。1896年，研究人员就在一例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出CTC的概念[6-7]。当人的循环系统中出现肿瘤细胞即提示肿瘤存在转移的可能性。对于CTC的检测来说，癌细胞从循环介质中分离之后的鉴定尤为重要[8]。目前，全世界范围内已经研究出多种CTC的检测方法，其中最常见的鉴定方法为美国强生公司开发的荧光细胞染色鉴定方式[9-10]。而在国内，目前尚无同类的国产CTC检测产品通过食药监管理部门的注册。为此，本项目组开展了一款新型的自动荧光显微分析系统用于临床CTC的检测。

作为一款临床检验分析仪器，自动荧光显微分析系统的质量控制必须符合原国家食品药品监督管理总局的相关法律法规要求。然而，市场上现有的质控方式不具有普适性，仅适用于厂家自己的系统。为了解决自动荧光显微分析系统的质控问题，我们创新性地设计了荧光细胞标准计数样片。该样片选取特制的带有黑色方框的载玻片，用多聚赖氨酸进行防脱处理[11]，分别制备空白对照、阳性样片A、阳性样片B三种规格，其中阳性样片上分别固定有特定数量的荧光染色肿瘤细胞。经上海市计量测试研究院测试确认后，我们将此标准计数样片作为企业内部的测试工具，用于对自动荧光显微分析系统成品的分析准确性、分析精密度、分析复现性等性能指标进行质控。由于荧光细胞标准计数样片可提供标准可控的荧光标记物，除可以应用于自动荧光显微分析系统的质控外，该标准样片还可以用于其他荧光成像及图像分析类系统的荧光成像及目的细胞计数能力的评价，也可以作为此类系统的一种通用测试工具。

1 材料和方法

1.1 材料

定制载玻片（含10 mm×10 mm黑框）、多聚赖氨酸、超纯水、棉签、SK-BR-3细胞（乳腺癌细胞）、Anti-CK8/18-FITC荧光抗体、DAPI染色液、甘油、中性树胶、盖玻片。

1.2 方法

1.2.1 载玻片防脱处理

载玻片防脱处理过程为：① 取3 mL多聚赖氨酸，用2 mL超纯水进行稀释，混匀后备用；② 取棉签1根，蘸取稀释好的多聚赖氨酸溶液，让棉签吸满液体为止；③ 左手持定制载玻片，右手用棉签顺着一个方向均匀涂满载玻片黑框区域；④ 将涂布好的载玻片依次放置于染色架中，至于阴凉通风处，干燥后备用。

1.2.2 荧光细胞标准计数样片的制备

（1）取消化好的SK-BR-3细胞，分别用Anti-CK8/18-FITC荧光抗体和DAPI染色液对其进行染色，染色完成后对其进行细胞计数，备用。

（2）取3片处理好的载玻片，分别标记为空白对照、阳性样片A、阳性样片B。其中，向阳性样片A、阳性样片B的黑色方框内分别滴加一定数量的荧光染色SK-BR-3细胞，细胞数量分别控制在50±5个、100±10个。空白对照样片不添加荧光染色SK-BR-3细胞。加好细胞的样片放置暗室1 h使液体基本挥发完毕。

（3）向三块载玻片的黑框中心区域分别滴加5 μL甘油，并沿着黑框滴加中性树胶，最后盖上盖玻片，确保盖玻片平整覆盖在黑框区域上且无甘油溢出。用擦镜纸擦去盖玻片边缘多余的中性树胶后放置于暗室中室温过夜晾干。

（4）用荧光显微镜对样片中的细胞进行计数，目的细胞识别条件为：明场可观察完整细胞形态，同时在荧光场下相同位置可分别观察到绿色荧光和蓝色荧光。重复计数3次后取平均值，阳性样片A、阳性样片B的细胞数平均值在50±5个、100±10个范围内则视为合格的荧光细胞标准计数样片，荧光细胞标准计数样片结构示意图，见图1。

图1 荧光细胞标准计数样片的结构示意图

1.2.3 自动荧光显微分析系统质量控制检测

1.2.3.1 分析准确性

对阳性样片A、阳性样片B各测试10次，按照以下公式(1)和(2)计算测试平均值：

式中Xi为每次的测试值；n为测试次数。

按下列公式计算准确性：

式中X0为标准值；X为测试平均值。

1.2.3.2 分析精密度

采用计算得到的平均值，按下列公式(3)和(4)计算变异系数：

式中X为测量平均值；Xi为第i次测试读数；n为测量次数；SD为标准差；CV为变异系数；

1.2.3.3 分析复现性

每隔0.5 h为一个间隔，重复测试三次，计算平均值，一共测试4个间隔，取5个结果中的最大值（最小值），按下列公式(5)计算仪器复现性误差：

式中S0为初始测试的读数平均值；Si为测试结果平均值中的最大值（最小值）；i=1, 2, 3, 4, 5。

2 结果

2.1 分析准确性

自动荧光显微分析系统对阳性样片A和阳性样片B上荧光细胞数结果，见表1。

根据以上测试结果，计算得出阳性样片A和阳性样片B的细胞个数测试平均值分别为97和50。上海市计量测试技术研究院对两种阳性样片细胞个数的计量确认值分别为96和49，以此为真值（以下相同），计算可得自动荧光显微分析系统对阳性样片A和阳性样片B的测试准确性分别为98.96%和97.96%。

2.2 分析精密度

根据表1的测试结果可计算出自动荧光显微分析系统对阳性样片A和阳性样片B的测试SD值分别为1.67和1.00，所以计算得到CV值分别为1.72%和2.00%。

2.3 分析复现性

对阳性样片A、阳性样片B的复现性测试结果，见表2和表3。由表2和表3的数据可计算出阳性样片A和阳性样片B复现性误差分别为0.34%和1.33%。

表2 阳性样片A复现性检测结果（细胞个数，个）

表3 阳性样片B复现性检测结果（细胞个数，个）

3 讨论

本研究制备了一种荧光细胞标准计数样片，该样片以定制的带框载玻片为载体，经过多聚赖氨酸防脱处理后，将一定数量的染色目的细胞封闭在方框区域内。根据加入的细胞多少，分为空白片、阳性A和阳性B三种规格。通过以上实验结果可以看出，用制备的荧光细胞标准计数样片对自动荧光显微分析系统的分析准确性、分析精密度以及分析复现性进行测试，测试结果良好。

相比较常规的载玻片，本标准样片使用了独特的定制方框加防脱处理工艺。这种独特的设计利用细胞中的阴离子和聚合物阳离子之间的相互作用产生粘合力，从而保证载入的目的细胞可以被牢牢地吸附在玻片表面而不脱落[12]；同时将细胞限定在黑色方框区域内，便于仪器快速对荧光信号进行定位和识别。

由于我们的检测系统是用于对CTC进行计数，我们参考同类技术并选用上皮源的SK-BR-3细胞来制作标准样片[13]，并对其进行染色（细胞表面染绿色、细胞核染蓝色）后制片。在对自动荧光显微分析系统进行质量检验时，荧光细胞标准计数样片可与检测系统单独使用，无须配套检测试剂。而强生公司的质控方法是使用特定的荧光标记细胞，其本身是一种封闭式系统，所以需要对检测系统内的仪器及配套试剂进行同时质控[14-16]。相比较而言，我们的荧光细胞标准计数样片具有使用简单、无须前处理直接用于测试、在有效期内可重复使用、可直接储存于常温环境等优点。

荧光细胞标准计数样片为开放式测试工具，如果根据测试需求对样片上的目的细胞或者荧光染料进行替换，可适用于其他类型细胞自动计数。因此，此方法可以作为一种通用手段，针对不同的预期用途设计不同的荧光细胞标准计数样片。

由于荧光物质无法避免淬灭问题，这导致我们的荧光细胞标准计数样片目前无法做到长期储存和使用。提高荧光物质的稳定性将对延长标准样片的有效期具有重要意义，未来需要着眼于此，力争制备出有效期更长的荧光细胞标准计数样片。

4 结论

本研究制备了一种荧光细胞标准计数样片，通过使用特制的载玻片为载体，经过防脱处理后添加一定数量的荧光染色细胞，制得不同规格的荧光细胞标准计数样片。利用该样片对自动荧光显微分析系统的分析准确性、精密度、复现性进行研究，实验结果表明，样片效果良好，可作为自动荧光显微分析系统的测试工具，用于该系统对上皮源循环肿瘤细胞自动计数功能的评价，成功地解决了该系统的质控问题。下一步，需要深入对荧光染料淬灭问题进行研究，做好荧光染色细胞的荧光防护，力求延长荧光细胞标准计数样片的有效期。