紫苏叶-黄芩药对抑制神经氨酸酶活性的最佳配比研究*

汪静宜 鲁银均 吴巧凤#

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

2 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

中医学认为，紫苏叶可行气和胃，解表散寒；黄芩擅清热燥湿，泻火解毒。临床上，两药常以不同比例配伍出现在治疗流感的方剂中。神经氨酸酶（NA）是流感病毒表面的一种包膜糖蛋白，在流感病毒的传播过程中发挥重要作用。本文以药对对NA活性的抑制率为评价指标，采用辐射设计法确定紫苏叶-黄芩药对的不同配比，通过响应曲面法评价不同配比的药对与抑制NA活性的关系，以确定紫苏叶-黄芩药对的最佳配比。

1 材料

1.1 药材：紫苏叶（批号：171001；产地：浙江）和黄芩（批号：170701；产地：内蒙古）均购自浙江中医药大学中药饮片厂，并经浙江中医药大学中药资源教研室俞冰副教授鉴定，分别为唇形科植物紫苏Perilla frutescens（L.）Britt.的叶和唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。

1.2 试剂：神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒P0309[包含1ml神经氨酸酶荧光底物2′-（4-methylumbelliferyl）-D-N-acetylneuraminic acid（MUNANA）、50μl神经氨酸酶、10ml神经氨酸酶检测缓冲液和1.20ml Milli-Q水，碧云天生物技术研究所]；生理盐水（批号：B16010402，浙江国境药业有限公司）；奥司他韦胶囊（批号：M1025，瑞士巴塞尔豪夫迈·罗氏有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器：荧光酶标检测仪（FLUOstar OPTIMA，德国BMG公司）；荧光酶标板（96孔，美国COSTAR公司）；电子分析天平（AB135-S，梅特勒-托利多仪器有限公司）；超速离心机（Centrifuge 5810R，德国Eppendorf公司）；超声波清洗器（KQ5200，昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 药对的配伍设计与制备：实验采用辐射设计，将二维坐标分为8个等分[1]，得到9种不同的配伍比例（1:0、5:1、5:2、3:2、1:1、2:3、2:5、1:5、0:1），具体见图1（紫苏叶:黄芩以苏-芩表示）。分别精密称取紫苏叶、黄芩粗粉，混匀，每份均设为15g，用20倍量的水煎煮2次，每次1h，趁热过滤，合并滤液，浓缩滤液至相当于含生药量0.5g/ml，得相应的药对提取液，于4℃冷藏，临用时以生理盐水稀释至所需浓度。

图1 紫苏叶-黄芩药对9个不同配比

2.2 神经氨酸酶抑制率的测定[1-2]：取96孔荧光酶标板，设置酶对照组、空白对照组、阳性对照组（奥司他韦，5个不同浓度：0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml）及药对组（9个不同配比），每组3孔。各组加入神经氨酸酶检测缓冲液70μl/孔，再各加神经氨酸酶10μl/孔（空白组不加），阳性对照组加5个不同浓度的药液，药对组加9个不同配比的药液（各稀释7个浓度）。振荡混匀约1min后，37℃下孵育2min，以使抑制剂和神经氨酸酶充分相互作用，然后每孔加入10μl神经氨酸酶荧光底物，振荡混匀约1min后，37℃下孵育20min后进行荧光测定（激发波长360nm，发射波长440nm），计算抑制率及半抑制浓度（IC50）。测定结果见表1（其中奥司他韦的IC50为0.021mg/ml，酶对照组抑制率视为0）。各组数据与酶对照组均具有显著性差异（P＜0.05）。

由表1可知，药对配比在1:1左右时，其IC50最小，提示紫苏叶-黄芩药对在1:1配比时对神经氨酸酶抑制 活性作用最佳。

表1 各组对NA活性的抑制率（n=3）

2.3 药效学模型：中药具有多成分多靶点共同作用的特点，采用二次多项式描述紫苏叶和黄芩两药合用的量效曲线，响应指数表示其相互作用强度。将响应指数减1，以0为典型的加和作用，便于绘图。结果见图2。

2.4 相互作用评价：在三维响应曲面模型图中，颜色深浅表示两药相互作用的强度。当响应指数接近于0时，药物间表现为相加作用；大于0时，表现为拮抗作用；小于0时，表现为协同作用。指数值越高，则相互作用强度越大，响应曲面图中表现为颜色接近于浅色或深色两端。X轴表示不同剂量的黄芩单味药，Y轴表示不同剂量的紫苏叶单味药，Z轴表示药对在不同剂量下的抑制率。采用SPSS17.0软件处理数据，实验数据用-x±s表示，采用Matlab软件进行拟合模型确定参数。以流感病毒NA活性抑制率为评价指标，拟合三维响应曲面模型，见图2。当紫苏叶、黄芩配比在1:0.92～1:1.67之间时，其协同作用显著（协同作用强度-0.80）。其他配比协同作用较弱，或产生相互作用甚至具有拮抗作用。

图2 药对三维响应曲面图

3 讨论

本文采用底物荧光检测法考察紫苏叶-黄芩药对不同配比对神经氨酸酶的抑制作用，发现紫苏叶-黄芩药对配比为1:1时，IC50最小。结合前期对“中国方剂数据库”中含紫苏叶-黄芩药对的古方统计分析结果，发现1:1配比出现的频率最高（占总数的25.6%）；在主治普通感冒及流感的方剂中，1:1配比出现的频率也最高（占总数的44.4%），与本实验结果一致，从而反映药对在方剂中使用的科学性。响应曲面图是由特定的响应值与对应自变量所构成的三维图，可直观地反映出各自变量对响应值的影响[2-3]。响应曲面法可定性、定量地研究药物间药效学相互作用规律，并能寻找最佳阈值反应范围[4]；辐射设计是一种从全局考虑药物不同配伍比例的方法，相比仅凭临床经验的少数几个参数设计更全面合理。辐射设计-响应曲面分析法两者合用，目前已应用于多种药对[1，5]与相关药效间的最佳配比研究。本文采用该方法探讨紫苏叶-黄芩药对不同配伍比例对抑制神经氨酸酶活性的影响，发现紫苏叶:黄芩在1:0.92～1:1.67时，协同作用明显，结合古方分析，最终确定1:1为抗流感病毒神经氨酸酶最佳配比。本文结果可为紫苏叶-黄芩抗流感病毒配伍比例的选择提供参考，并为其他相关研究提供思路与方法。

4 参考文献

[1]陈高，吴巧凤，张小霞，等.黄连-厚朴药对9个配伍比例对抑制神经氨酸酶活性的影响[J].中成药，2017，39(7)：1394-1397.

[2]崔文燕，刘素香，赵艳敏，等.响应曲面法优化黄花败酱总皂苷提取工艺及体外促进肠平滑肌收缩活性[J].中草药，2016，47（12）：2078-2083.

[3]吕佳妮，陈素红，徐娟华.铁皮石斛根中石斛多糖的响应面法提取优化研究[J].浙江中医杂志，2014，49（6）：459-461.

[4]史旭芹，尚尔鑫，唐于平，等.基于响应面法对当归-黄芪配伍养血补血功效相互作用研究[J].药学学报，2012，47（10）：1375-1383.

[5]黄美艳，唐于平，尚尔鑫，等.基于响应面法对归芎药对活血效应相互作用研究[J].中国药理学通报，2012，28（10）：1407-1412.