SLC26A3与NHERF4在溃疡性结肠炎小鼠肠道组织中的动态表达研究

杨奉天，王 艳，黄俊凯，李 婉，徐丽红

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性复发性的肠道炎症性疾病，近年因其逐年增高的发病率而成为消化系统疾病的研究热点[1]。UC发病机制复杂，肠黏膜屏障及细胞屏障功能受损是其发病的重要机制之一[2]。溶质载体26A3(solute carrie 26A3，SLC26A3)是哺乳类动物肠上皮细胞顶端膜上主要Cl-/HCO3-离子转运体[3]，其功能缺陷所引起的HCO3-分泌减少及Cl-吸收异常可以导致黏膜屏障的稳定性下降[4]，已有研究[5]证实UC患者中存在SLC26A3的表达缺陷，但其发生机制并不清晰。钠氢交换体调节因子4(sodium/proton exchanger regulatory factor 4，NHERF4)是主要表达在肠道中的PDZ结构域蛋白(PDZ-domain proteins)[6]，既往细胞学研究[7]显示NHERF4可负性调控SLC26A3的表达，NHERF4可能在UC发展中参与调控SLC26A3的表达，但目前尚无文献证实NHERF4在UC中的表达改变。该研究利用恶唑酮(Oxazolone，OXZ)法制备C57BL/6J小鼠结肠炎动物模型，观察其远端结肠中SLC26A3和NHERF4 mRNA和蛋白的动态表达，初步评估NHERF4/SLC26A3是否参与UC的发生发展。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 48只雌性SPF级C57BL/6J小鼠由新疆自治区实验动物研究中心提供。6周龄，体质量16～18 g，状态优良，常规饲养。

1.1.2主要试剂与仪器 OXZ致敏剂(生产编号：MKBS4435V)购自美国Sigma公司；细胞浆蛋白与细胞膜蛋白提取试剂盒购自北京碧云天公司；RIPA总蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝公司；SLC26A3 Western blot抗体(编号：sc-376187)购自美国Santa公司；NHERF4 Western blot抗体(编号：ab182507)购自美国Abcam公司；β-actin抗体、山羊抗小鼠及山羊抗兔抗体购自北京中杉金桥公司；荧光定量PCR试剂盒购自德国Qiagen 公司；cDNA合成试剂盒、低温高速离心机、紫外分光光度计购自美国Thermo公司；Bio-RAD电泳仪、转膜仪购自美国BIO公司；SLC26A3、NHERF4基因引物设计、合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2方法

1.2.1OXZ法建立C57BL/6J小鼠结肠炎模型 48只C57BL/6J小鼠称重后按质量顺序编号，随机数表法分为对照组(n=24)与实验组(n=24)。实验组小鼠腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，背部备皮，4% OXZ(100%乙醇溶剂)1 ml溶液涂抹2 d，第7天戊巴比妥钠麻醉后，直肠灌注质量分数为1%的OXZ(50%乙醇溶剂)0.3 ml。对照组小鼠无水乙醇1 ml背部涂抹，直肠灌注50%酒精溶液0.3 ml。保留灌肠30 min后拔出灌肠器。

1.2.2采用UC疾病活动指数(disease activity index，DAI)评价小鼠结肠炎严重程度 在造模过程中，每日测量并记录小鼠体质量、粪便含水、大便性状、大便潜血和血便等指标。DAI评分参考Sutherland et al[8]标准：隐血实验阴性且粪便成形0分；粪便松散不粘附肛门，若隐血阴性1分，阳性2分；粪便液态且隐血阳性3分；肉眼血便4分。

1.2.3病理组织学观察小鼠结肠黏膜炎症情况 根据DAI变化趋势，选取第6、8、10、14天作为小鼠结肠炎活动前期、活动期、恢复期的时间节点(该实验数据来源于前期预实验)，留取组织标本。1%戊巴比妥钠60 mg/kg 腹腔注射麻醉小鼠，取远端结肠1/3(约距肛口1 cm)，剪开结肠后4 ℃生理盐水冲洗干净，4%甲醛溶液固定24 h后石蜡包埋，切片，经二甲苯脱蜡和乙醇水化，苏木精-伊红染色，乙醇水化，晾干后封片，行组织病理学观察。

1.2.4qRT-PCR 检测小鼠肠组织SLC26A3与NHERF4的mRNA水平 ① 分别于实验进行第6、8、10、14天，将小鼠麻醉后剖腹，取距肛口1 cm内结肠组织;② 用TRIzol 法提取结肠组织的总RNA，紫外分光光度计测量总RNA的浓度与纯度，选取吸光度值(optical density，OD) 260 nm/OD280 nm的值在1.8～2.0范围内，按照cDNA合成试剂盒说明书进行逆转录;③ SLC26A3上游引物序列为：5′-TTCCCCTCAACAACATCACCATCC-3′，下游引物：5′-GTCTGCCTTGTGGTTGTCCT-3′；NHERF4上游引物序列为：5′-TTCACTCACAACCAACTCACCAG-3′，下游引物：5′-CAGGAACTGTCCAGGGCGAC-3′；β-Actin上游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′;④ 采用荧光定量PCR试剂盒在64孔ABI Prism 7300序列检测系统进行检测。内参基因与目的基因各重复3次，同时设3个阴性对照，建立总体积为20 μl的反应体系，反应条件为：95 ℃、2 min(1个循环)；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s(40个循环)，循环结束后得到扩增曲线；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min；95 ℃、30 s，60 ℃、15 s后得到溶解曲线。

1.2.5Western blot观察SLC26A3及NHERF4蛋白的定量表达 液氮保存标本，取出，根据试剂盒说明书分别提取膜蛋白及总蛋白，测蛋白浓度，5×上样缓冲液混匀后煮沸8 min使蛋白变性。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后5%牛血清(BSA)洗涤，缓冲液(TBST)室温封闭2 h，5% BSA的TBST稀释SLC26A3(1 ∶100)和NHERF4(1 ∶1 000)抗体，β-actin(1 ∶1 000)作为内参，4 ℃过夜。洗膜后5% BSA的TBST稀释抗兔和抗鼠的二抗(均为1 ∶10 000)37 ℃孵育2 h，洗膜后显色，暗室内胶片曝光。采图后Gel-pro软件图像数据分析灰度值。

2 结果

2.1小鼠粪便含水量、体质量、DAI变化趋势

2.1.1粪便含水量 小鼠粪便含水量呈现先增高后减少的趋势。实验组在第8天粪便含水量明显增高，第10天达到高峰。实验组第8天粪便含水量(69.92%±5%)较实验开始时增高(40.47%±6.5%，P<0.05)，在第10天最高(95.56%±2.3%)，对照组第8天的粪便含水量(49.2%±4%)与实验开始时变化不显著(40.92%±13%，P>0.05)，见图1。

图1 小鼠粪便含水量变化

2.1.2小鼠体质量 实验组体质量先升高后减少。实验组体质量于第8天开始明显下降[(17.65±1.04) g]，较实验组第7天明显下降[(18.73±0.7) g，P<0.05]，对照组第8天体质量[(16.25±0.5) g]与实验开始时[(16.24±0.4) g，P>0.05]比较，变化不显著，见图2。

图2 小鼠体质量变化趋势

2.1.3小鼠DAI变化趋势 实验组在第8天出现大便不成形，且部分出现肉眼血便，其第8天DAI评分(1.26±0.26)较实验开始时(0.42±0.21)明显增高(P<0.05)，且高于同期对照组DAI评分(0.94±0.3，P<0.05)，其第14天DAI评分(2.3±0.8)较第10天 (2.61±0.4)下降，但仍高于对照组第14天的DAI评分(0.2±0.1)，见图3。即实验组DAI评分在第8天开始上升，第10天达到峰值，第14天下降，呈先上升后降低趋势。

图3 小鼠DAI变化趋势

2.2结肠黏膜组织学观察结肠黏膜大体组织学观察：实验组第8天出现远端结肠黏膜红肿、充血，部分结肠黏膜表面可见脓苔附着，并有溃疡形成，病变以中远段结肠为主，同期对照组远端结肠黏膜仅轻微水肿，无糜烂，无溃疡形成。结肠黏膜显微镜下病理组织学观察：对照组各时间点结肠黏膜无异常炎性细胞浸润；实验组第6天结肠黏膜与对照组相似，实验组第8天及第10天结肠黏膜可见上皮细胞脱落，正常杯状细胞减少、萎缩，淋巴细胞浸润，可见隐窝脓肿，炎症局限于黏膜和黏膜下层，实验组第14天结肠黏膜未见明显肠上皮细胞缺失，正常杯状细胞较前增多，炎细胞减少，见图4，箭头所指为隐窝内脓肿。提示实验组小鼠结肠黏膜病理组织学改变与人UC结肠黏膜病理组织学改变相似。

2.3小鼠肠道组织的SLC26A3mRNA表达水平与对照组比较，实验组小鼠肠道组织的SLC26A3 mRNA的表达降低，且实验组第8 、10天表达均低于同期对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。小鼠肠道组织NHERF4 mRNA的表达，实验组第8天表达高于同期对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4SLC26A3与NHERF4的蛋白表达Western blot检测SLC26A3蛋白定量表达的结果显示，与同期对照组比较，实验组各时间点结肠黏膜中SLC26A3的表达均降低，其中以第10天差异最为显著(对照组第10天vs实验组第10天：0.83±0.05vs0.13±0.01，P<0.05)；同时在实验组炎症进展、恢复过程中，以第10天 SLC26A3表达水平最低(第10天vs第6天：0.13±0.01vs0.76±0.03，P<0.05；第10天vs第14天：0.13±0.01vs0.31±0.04，P<0.05)，见图5，即小鼠肠黏膜中SLC26A3表达在炎症活动期降低的更为明显。Western blot检测NHERF4蛋白定量表达的结果显示，与同期对照组比较，实验组各时间点结肠黏膜中NHERF4的表达明显增高，其中以第8天差异最为显著(对照组第8天vs实验组第8天：0.23±0.004vs0.56±0.02，P<0.05)；同时在实验组炎症进展、恢复过程中，以第8天的表达水平最高(第8天vs第6天：0.56±0.02vs0.32±0.02，P<0.05；第8天vs第14天：0.56±0.02vs0.34±0.02，P<0.05)，见图5，提示在活动期结肠黏膜中NHERF4的表达明显上升。尽管实验组第14天结肠黏膜中NHERF4的表达水平开始下降，但与同期对照组比较，其表达水平仍明显增高(实验组第14天vs对照组第14天：0.34±0.02vs0.20±0.02，P<0.05)，这可能与肠道黏膜细胞功能尚未完全恢复有关。

2.5NHERF4、SLC26A3与DAI在疾病发展过程中的相关性分析实验组DAI评分先增高后降低，在第10天出现峰值，随后进入炎症减轻阶段，直至第14天DAI评分呈逐渐下降趋势，同时，实验组肠黏膜中SLC26A3的降低与DAI评分的升高同步出现，并维持至DAI评分最高时，在后期DAI评分逐渐降低时，其表达呈缓慢上升趋势，即SLC26A3的表达与DAI评分呈相反的趋势，呈先降低后增高。NHERF4的表达与DAI评分呈相似的趋势，先增高后降低，但在DAI评分开始上升时NHERF4表达处于峰值，而后期DAI评分最高时，NHERF4表达呈逐渐下降趋势。本组结果提示，在肠道炎症的进展恢复过程中始终伴随着SLC26A3和NHERF4的表达改变，且NHERF4的表达升高可能先于肠道炎症症状的出现。见图6。

图4 小鼠结肠炎模型HE染色 ×400

A：实验组6 d；B：实验组8 d；C：实验组10 d；D：实验组14 d；E：对照组6 d；F：对照组8 d；G：对照组10 d；H：对照组14 d

表1 肠道组织SLC26A3 mRNA、NHERF4 mRNA水平比较

与对照组比较：*P<0.05

图5 动物模型实验SLC26A3/NHERF4的表达

A：实验组6 d；B：实验组8 d；C：实验组10 d；D：实验组14 d; E：对照组6 d；F：对照组8 d；G：对照组10 d；H：对照组14 d

3 讨论

UC是一种以结肠黏膜层和黏膜下层损伤为主的慢性炎症性肠道疾病[9]，肠黏膜屏障功能缺陷及肠上皮细胞屏障功能减退在UC发病中具有重要作用[2,10-11]。

既往研究[12-13]显示，SLC26A3是在肠道丰富表达的Cl-/HCO3-交换体。肠黏膜化学屏障是一种主要由黏蛋白构成的网状胶体，分泌型黏蛋白2(mucin 2, MUC2)是其主要成分[4]。相关报道显示，UC中存在SLC26A3的表达异常，其功能缺陷可引起MUC2表达异常，继而导致屏障稳定性的下降及肠黏膜屏障功能的减退[4]，使肠道菌群得以与肠上皮细胞密切接触[2]，引起肠道炎症的发生，即SLC26A3的功能缺陷与UC的疾病发展密切相关。本研究与既往文献[5]的研究结果相似，在肠道炎症进展过程当中，SLC26A3确实存在有表达缺陷，但本研究还表明，SLC26A3在肠道炎症活动期的表达低于疾病前期、恢复期及正常小鼠SLC26A3的表达，具体表现为SLC26A3的表达与小鼠肠道炎症程度、腹泻等变化一致，提示在肠道炎症进展过程中SLC26A3表达的改变不仅与炎症活动度有关，还与腹泻症状有关；并且黏膜屏障损伤与UC患者肠黏膜恢复后临床症状持续存在有关[14]，SLC26A3的正常表达与肠黏膜屏障相关[4]，从而推测SLC26A3表达的异常可能与UC患者肠黏膜恢复后临床症状持续存在具有一定相关性，但这一结论还需要进一步的实验进行验证分析。

图6 SLC26A3、NHERF4蛋白表达趋势与DAI评分趋势

A：实验组6 d；B：实验组8 d；C：实验组10 d；D：实验组14 d

钠氢交换体调节因子(sodium/proton exchanger regulatory factor，NHERF)蛋白家族是在上皮细胞中丰富表达的PDZ结构蛋白[15]，其亚型NHERF4可与胃肠上皮的多种转运体相互作用，尤与SLC26A3的结合最强，并负性调控SLC26A3在细胞膜处的表达[6-7]，在UC发展过程中，SLC26A3的降低与NHERF4的表达可能具有相关性，但未见NHERF4在UC中表达的相关研究。本研究结果首次证实，在结肠炎模型小鼠处于疾病活动期时确实存在肠黏膜中NHERF4的表达明显增高。此外，本研究结果还显示，NHERF4的表达升高可能先于肠道炎症症状的出现，并随炎症恢复其表达水平呈略落后的逐渐降低，提示NHERF4可能可作为判断UC发展的预测指标。同时，通过比较分析NHERF4、SLC26A3和DAI在疾病发展过程中的相关性，本研究结果显示，在肠道炎症发展过程中，SLC26A3的表达降低与NHERF4的表达增高是相伴随而存在的，且NHERF4与SLC26A3的降低增高在时间点上具有一定的重合性， UC中可能存在NHERF4对SLC26A3表达的负向调控，但该结论仍需进一步的干预实验进行验证。

本研究结果不仅为进一步研究UC发展过程中SLC26A3表达改变的机制提供了前期实验数据和新的思路，同时，若本研究结果能够得到进一步证实，还可为UC的治疗提供新的靶点，如通过使用下调NHERF4或阻断NHERF4与SLC26A3结合的药物来改善肠黏膜中SLC26A3的表达，为减轻UC患者临床症状和复发提供新的治疗方案。