弱精子症分子遗传学的研究进展

张国晖，梁高照综述；汪 清审校

(1.广东医科大学，广东湛江 524000;2.广东医科大学深圳宝安临床医学院/深圳大学第二附属医院/深圳市第八人民医院/深圳市宝安区人民医院，广东深圳 518100)

弱精子症(asthenozoospermia,AZS)是指精子活力PR级(a级+b级)<32%的病症，主要依靠常规精液分析进行诊断，是男性不育最常见的类型。常规精液分析是判断男性生育能力及诊断AZS的临床指标，但不能解释精子运动缺陷的根本原因。AZS病因众多，目前尚未阐明AZS形成的根本机制。精子的运动功能是由无数基因和各种信号通路共同协调的，目前普遍认为，分子遗传学改变是AZS发生的中心环节。近年来，随着高通量测序和基因芯片技术的发展，目前已经发现部分基因改变及基因调控异常在AZS形成中发挥关键作用，包括精子鞭毛相关基因突变、线粒体DNA突变、miRNA调控异常及端粒长度改变。本文重点讨论国内外关于AZS分子遗传学改变的最新研究进展。

1 基因突变

精子鞭毛多发性形态异常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF)是一种严重的精子鞭毛畸形，包括缺失、盘绕、弯曲、有角度、不规则和短鞭毛[1]。精子运动主要依靠鞭毛摆动提供前进动力。MMAF是降低精子运动力和活力的重要器质性病变。基因突变是引起MMAF的主要原因，目前研究发现大范围核苷酸缺失插入和单核苷酸突变均能导致鞭毛形态异常。

既往只有AKAP4、CCDC39和DNAH1三种基因被认为是MMAF相关基因[2-4]，其中DNAH1突变是主要因素，约占MMAF的28%～44%[1-2]。早在2001年，NEESEN等[5]就报道DNAH1基因突变能引起纤毛摆动频率降低和AZS。近年来，越来越多文献报道DNAH1基因突变引起MMAF及AZS[6]。DNAH1是一个含有78个外显子的基因，编码内臂动力蛋白重链，参与形成鞭毛中心结构。DNAH1基因突变导致内臂动力蛋白形成及功能障碍，引起精子鞭毛多发性形态异常、精子纤维鞘发育不良(dysplasia of sperm fibrous sheath,DFS)、精子运动障碍及男性不育。DNAH1基因高度表达于睾丸，突变不引起体表纤毛功能改变[1]。据报道，鞭毛异常与非整倍体频率升高和卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)疗效差有关。然而，最近一项研究显示，DNHA1突变的MMAF患者具有较低的非整倍体率和较高的DNA完整性，DNAH1突变MMAF患者与非MMAF患者相比，接受ICSI治疗后的受精、妊娠和活产率并没有统计学差异[7]。这表明并非所有MMAF患者都存在染色体畸形，同时也为DNHA1突变患者的治疗提供了新的见解。

近2年来，研究发现CFAP43、CFAP44、CFAP69及CFAP251也是引起MMAF的基因之一[8-11]。TANG等[12]首次表明CFAP43和CFAP44中的双等位基因突变可导致MMAF并损害精子活力。CFAP43(也称为WDR96)位于10号染色体上，含有38个外显子，编码含1 665个氨基酸的蛋白质。CFAP44(也称为WDR52)位于3号染色体上，含有35个外显子，编码含1 854个氨基酸的蛋白质[11]。其编码的蛋白质TbCFAP43和TbCFAP44含有WD重复结构域(WDR)，比如N-末端区域共有β-链结构域，C-末端区域共有α-螺旋结构域，集中表达于鞭毛轴丝微管5、微管6和副鞭毛竿之间，精细调控该区域的蛋白质复合物，在维持轴丝超微结构中具有重要作用[11]。CFAP43和CFAP44基因突变诱导鞭毛轴丝解体，引起MMAF，表明CFAP43和CFAP44是精子鞭毛组装和稳定性所必需的基因，与精子鞭毛缺陷和AZS相关[11]。CFAP43和CFAP44不表达于体表细胞纤毛，突变不会引起原发性纤毛运动障碍(primary ciliary dyskinesia,PCD)[12]。CFAP43和CFAP44突变的MMAF患者通过ICSI治疗可获得较为满意的妊娠率[13]。CFAP69高度表达于睾丸，编码位于鞭毛中段相对保守的蛋白质，CFAP69的完整表达对于鞭毛组装及稳定结构是不可或缺的，CFAP69双等位基因突变不会影响精子发育过程，但能够引起精子头部严重畸形及鞭毛严重缺陷，导致常染色体隐性MMAF和原发性不育[8]。CFAP251编码位于外周微管双层内表面蛋白质，在稳定RS3结构和控制鞭毛运动中起重要作用，CFAP69突变影响精子线粒体鞘形成、鞭毛形态，导致男性不育[9-10,14]。此外，腺苷酸激酶7中的纯合错义突变L673P也会引起MMAF和导致男性不育，并且不导致PCD[15]。

单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，也是引起AZS的突变类型。白细胞介素(interleukin-1α，IL-1α)被认为是精原细胞的生长因子，参与精子发生。一项关于伊朗男性IL-1ɑC376A单核苷酸突变的研究[16]发现，C等位基因突变与AZS相关；另一项对IL-1ɑ4845G> T的遗传关联研究[17]显示，GT基因型、TT基因型、T等位基因与特发性男性不育之间存在相关性，4845TT基因型和4845T等位基因与少精子症、AZS和非阻塞性无精子症有关。然而这两项研究仅仅是初步研究，有待进一步验证及阐明机制；同时鉴于不同地理区域的环境因素不同，因此在不同种族和人群中进行更大样本规模的研究是很必要的。此外近来发现GRP78启动子突变[18]、FSIP2突变[19]也是引起AZS的重要因素。

2 线粒体DNA突变

线粒体(mitochondrial)是精子能量的加工厂，通过有氧氧化为精子生长发育、运动和受精等各个阶段供应能量，对精子活力和生育能力至关重要。线粒体DNA(mtDNA)缺失或突变通常导致精子活力下降，最后导致精子功能障碍和男性不育[20-22]。AMBULKAR等[23]发现AZS患者存在mtDNA7436-bp缺失，尽管mtDNA7436-bp缺失频率较低，但对照组并没有显示mtDNA缺失。这表明mtDNA7436-bp缺失与精子活力低下相关，是精子功能障碍和无运动精子的重要原因之一。GHOLINEZHAD等[24]研究发现，AZS患者和正常可育受试者中均存在mtDNA4866-bp、mtDNA4977-bp和mtDNA7436-bp缺失，但AZS中多个mtDNA缺失的频率显著高于正常受试者。研究结果表明mtDNA的大规模缺失与精子活动性降低和精子形态异常之间存在关联，尤其是AZS患者。一项关于伊朗男性不育人群的mtDNA分析表明mtDNA7599 bp缺失与男性不育有关，然而这只是一项初步研究，有待进一步验证[25]。综合目前研究结果[26-27]，mtDNA缺失导致精子运动性及活力下降的机制如下：第一，大规模mtDNA缺失致使其部分结构基因和tRNA基因完全缺失或截断表达，从而导致功能障碍；第二，含有mtDNA缺陷的精子进行氧化磷酸化活动时，不仅不能有效地生成ATP，反而会产生更多活性氧和自由基，进一步损害线粒体，同时促进mtDNA突变或缺失，最终导致精子能量危机、精子活力和生育力下降；第三，大规模mtDNA缺失在精子发育过程中形成并不断积累，最终损害呼吸功能并降低精子活力，这可能是男性生育能力下降甚至人体某些病理条件的重要因素之一。

除了mtDNA大范围缺失突变外，mtDNA单核苷酸点突变也会对精子质量产生影响。一项针对中国男性线粒体DNA的新一代测序(next-generation sequencing,NGS)及单核苷酸分析研究[28]显示，病例组C16179T基因突变发生率明显高于对照组，并引起精子总数和运动性下降。但研究结果有待在更大群体的进一步验证。另一项全基因组mtDNA单核苷酸多态性分析显示，MT-ND4基因突变m.11696G>A与精子活力降低有关，证明m.11696G>A突变增加AZS的风险[29]。目前关于单核苷酸点突变影响精子发生和精子活力的机制尚未阐明，推测mtDNA点突变可能通过降低线粒体呼吸链复合物的活性而导致精子功能障碍[29]。

3 miRNA调控异常

MiRNA是一类内源性具有调控功能的非编码RNA，长约20～25个核苷酸，可以调控大概60%蛋白质编码基因。MiRNA在多种生物过程中发挥重要作用，包括胚胎发生，细胞分化，器官发生，代谢和凋亡[30]。精子发生是一个复杂、高度组织的过程，其中转录后miRNA调控是必不可少的过程[31]。然而目前仅有少许文献报道了miRNA参与AZS调控。

精子miRNA表达谱分析发现AZS精子microRNA表达失调。与正常精子对比，AZS患者有50种miRNA表达上调，27种miRNA表达下调，其中miR-34b、miR-122、and miR-1973表达差异最大[32]。既往的研究表明miR-122在圆形精子细胞中通过靶向特定mRNA参与转录蛋白2(transition protein 2，TNP2)的转录后调节[33]，表明miR-122在睾丸发育或精子发生过程中起着重要的作用。miR-151a-5p是一种线粒体相关的miRNA[34]，既往多被认为参与肿瘤形成、肝脏和心脏损失过程。ZHOU等[34]研究发现AZS患者miR-151a-5p显著增加，并通过将miR-151a-5p转染至GC-2细胞系，发现miR-151a-5p通过下调细胞色素B表达，抑制线粒体电子传递链活性，减少ATP生成，导致精子细胞运动性减少。该研究首次系统性证明线粒体相关miRNA在AZS中的作用，揭示了miR-151a-5p通过调节CYTB水平导致AZS的分子机制，同时也为AZS治疗提供潜在靶点。糖酵解已被证明是哺乳动物精子鞭毛产生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的重要途径。let-7 miRNA家族参与了多种细胞过程和疾病发病机制的调节。let-7b-5p通过调节AURKB在细胞分裂过程中维持保真度。然而，关于let-7b-5p在生殖系统中的功能知之甚少。ZHOU等[35]分析糖酵解相关miRNA发现，与健康对照者相比，在重度AZS患者中仅发现1种精浆miRNA let-7b-5p显著降低，并且通过敲掉miRNA let-7b-5p证实糖酵解活性降低。该研究表明miRNA let-7b-5p表达下调可以通过参与抑制糖酵解，减少鞭毛生成ATP，降低精子运动力。线粒体和糖酵解都是精子运动的能量来源，相关调控miRNA表达失调容易引起能量崩溃及精子运动下降。

正常情况下，精子活力是在附睾中获得的，miRNA参与调节附睾微环境，为精子获得活力提供基础[36]。QING等[37]发现AZS患者中五种附睾miRNA(miR-891b，miR-892b，miR-892a，miR-888和miR-890)表达失调，表明miRNA群表达失调很可能是AZS的一种表观遗传基础。既往研究发现miR-34家族是精子发生所必需的[38]。LI等[39]研究发现miR-34c-3p和PLCXD3(phospholipase C X-domain containing 3)基因是一对miRNA-靶基因，PLCXD3位于睾丸生殖细胞内，在少AZS患者中低表达，miR-34c-3p能够降低PLCXD3表达，能够作为特发性少精症的标志物；同时该研究还发现未曾报道的miR-411-5p，miR-375，miR-410和miR-758在精子生成中发挥关键作用，但作用及机制有待进一步阐明。YANG等[40]发现隐睾患者睾丸组织中miR-34c明显降低，Nanos2蛋白质水平在小鼠模型中显著上调，miR-34c/Nanos2的异常表达破坏了精原干细胞自我更新和分化之间的平衡，最终破坏了隐睾睾丸的精子发生，该项研究为隐睾症引起的男性不育机制提供了新的见解。此外，据报道miR-27a、miR-629-3p也是精子活力的调控因子，表达失调可导致严重AZS[41-42]。目前的研究已经表明miRNA参与AZS的调控，但尚未发现AZS的特异性miRNA，有望进一步研究发现AZS特异性miRNA，为AZS的诊断和治疗提供新型生物标记物。

4 精子端粒长度改变

端粒包含非编码串联重复序列，可以保护染色体免受末端侵蚀，而不会导致遗传信息丢失。在生殖细胞中，端粒长度得以保留，表明端粒在维持人类配子发生和生育中的重要作用。研究发现精子端粒长度(sperm telomere length，STL)与精子质量显著相关[43]。STL与精子运动力和精子活力呈正相关，与精子DNA片段化呈负相关，可以作为衡量精子质量的标记物[43]；还有研究报道STL与精子活性氧含量之间呈负相关，STL缩短会导致精子ROS增多，降低精子质量；大量文献报道STL与精子数量存在线性关系，少精子症患者的STL比正常精子更短[43-45]。目前尚不清楚STL影响精子质量的机制，部分学者认为端粒可能发生分离错误，功能失调的短端粒诱导精子DNA断裂[46]，引起生殖细胞凋亡阻碍精子发生，生殖细胞中较短的端粒可能被认为是生精障碍和男性不育的一个新的推定原因；另一方面，端粒长度缩短可能是精子受损的标志，即端粒长度缩短可被视为后果，而不是精子发生改变的原因。然而，一些研究得出了截然不同的结论，认为STL与精子质量[47-48]、DNA片段化[47-49]、活性氧含量[48]无关，应慎重考虑把CTL作为衡量精子质量和男性不育的标记物。最近一项研究[50]通过比较分析STL与精液质量的关系及对预测辅助生殖的效果，认为端粒在人类生殖中起关键重要作用，强烈建议把STL作为男性不育的生物标志物。目前关于精子端粒长度在精子质量和男性不育方面的作用及机制尚无定论，有待进一步研究阐明。

5 总结与展望

AZS是男性不育的主要原因之一。精子的发生和运动是由众多基因共同协调的。近年来，关于精子发生和精子运动缺陷的基础研究已经取得了突破，目前的研究已经发现某些基因突变、miRNA表达失调、线粒体及鞭毛功能障碍参与AZS发生发展。然而，目前的研究多仅局限于单个基因改变引起的精子运动障碍，未来需要系统性的生物学研究，包括全方位考虑基因组学，转录组学，蛋白质组学，代谢组学和表观遗传学改变，进一步阐明AZS的病理生理学基础，为AZS诊断和治疗提供新的靶点。