创伤性脑损伤模型研究进展

赵清辉, 琚芳迪, 苏泽华, 罗秋丽, 仪 杨, 张晓康, 张 鑫, 谢 飞, 马雪梅

北京工业大学生命科学与生物工程学院, 北京 100124

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是世界范围内的严重问题。每年，全世界大约有1 000万人遭受创伤性脑损伤，并且相当多的患者会因此暂时或永久残疾、甚至死亡。有研究预测，到2020年，TBI将成为全球负担最重的第三大疾病[1～5]。此外，TBI被证实与癫痫、阿尔兹海默病、帕金森病、慢性神经炎等疾病密切相关[6～9]。为了寻找合理的TBI治疗方案，研究人员建立了许多体内动物模型和体外细胞模型，用于研究TBI的病理生理机制。鉴于临床上TBI发生情况各异，研究人员建立了不同类别的动物模型来复制不同类型的创伤性脑损伤，虽然较大的动物在尺寸上和生理上与人类更为接近，但由于啮齿类动物具有体积小、成本低、容易量化等特点，目前被广泛应用于TBI动物模型的建立[10,11]。早期的TBI动物模型主要模拟了脑损伤的生物力学变化，近年来创建的动物模型还可用于研究由头部创伤引发的分子相互作用机制以及分子级联反应[11,12]。同样的，体外TBI模型也是研究TBI病理生理机制的重要工具，其优势在于能够减少体内复杂因素的干扰，从而更准确地反映由机械损伤引起的细胞、组织的生物学变化。此外，与体内模型相比，体外模型具有重复性好、可控性好、实验成本较低、伦理问题较少等优势。根据致伤方式的不同，常用的TBI模型可分为机械作用力损伤模型、压力损伤模型、爆炸伤模型、反复性轻度损伤模型。本文对上述常用模型进行了综述和比较分析，以期为寻找在临床上具有神经保护效果的治疗方案提供帮助。

1 机械作用力损伤模型

1.1 机械作用力损伤TBI动物模型

机械作用力损伤TBI动物模型常用的有自由落体打击(weight-drop，WD)模型和控制性皮层冲击损伤(controlled cortical impact，CCI)模型。

WD是一种常用的造模方法，通过重物自由下落打击硬脑膜或者颅骨造成脑损伤，通常采用一根导管来引导重物自由下落，通过重物的重量和下落的高度来控制损伤程度[10,11,13]。Feeney WD模型是通过直接打击硬脑膜造成脑皮质挫伤，并通过调节撞击头的重量和自由下落的高度来建立轻度、中度、重度脑损伤模型，主要用于模拟脑震荡和脑挫裂伤[14～18]。Marmarou WD模型在Feeney模型的基础上做了2个方面的改进：①将麻醉大鼠固定在海绵平台上，既可确保外力的瞬时性，也可在打击后通过抽出海绵平台，避免二次打击；②在顶部正中放置1个直径1 cm、厚0.3 cm的金属片以确保外力作用的弥散性，主要用于模拟弥漫性脑损伤。此模型的优点是方法简单、条件易于控制等；缺点是致死率较高。

CCI模型是通过高速运动的空气所产生的冲击力带动金属撞击头直接打击暴露的硬脑膜，造成一定程度的脑损伤。其主要用于复制TBI后皮质组织缺失、急性硬膜下血肿、轴索损伤、脑震荡、血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)功能障碍甚至昏迷等症状。该模型可以通过调节撞击停留时间、撞击速度、打击深度来控制损伤程度[19～21]。与Marmarou WD模型相比，CCI模型改善了机械因素，极大降低了模型致死率；还可通过脑立体定位仪对颅脑打击位置精准定位，打击力度更为精确；同时，撞击后，撞击头自动迅速回收，避免了因挤压造成的损伤或因重物反弹造成的二次损伤[11,22,23]。总之，CCI模型致伤准确、重复性好、稳定性高，使TBI生物力学的研究更为有效。

1.2 机械作用力损伤TBI细胞模型

机械作用力损伤TBI细胞模型主要包括机械横断体外细胞模型(cell transection injury)和牵张损伤体外细胞模型(cell stretch injury)。

机械横断体外细胞模型是采用塑料细针、刀片或激光将附着在培养皿上的神经细胞突起与胞体离断，用于模拟穿刺伤、穿透性颅骨骨折以及TBI后各种脑组织病变。Faden等[24]采用1个由28个不锈钢叶片连接的冲击装置，对培养的大鼠皮层神经元细胞诱导机械损伤，切割装置在96孔组织培养板的细胞层中做均匀切割，间距为1.2 mm；24 h后通过检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)释放量来测定细胞活力。结果显示，切割装置直接导致叶片下的细胞死亡，24 h内，伤口周围的神经细胞逐渐死亡。随后，研究人员对模型进行改进，直接省去冲击装置，采用更为简单的黄色枪头(直径1.5 mm)和白色枪头(直径1 mm)机械性划割培养的大鼠皮层神经元细胞，根据划伤面积的不同来建立不同程度的损伤模型[25,26]。该模型无需特殊设备条件，操作简便，是一种简单有效的体外模型；而其不足是机械损伤参数无严格的标准，损伤严重程度仅以损伤细胞数目分级。

牵张损伤体外细胞模型是通过改变细胞形态造成细胞不同程度的伸展牵张，目的主要是为了研究TBI的生物力学效应。其中应用较为广泛的模型是通过压缩气体使夹持的圆形板变形，圆形板上贴壁的神经细胞也随之变形，根据施加的压力大小不同造成轻度、中度和重度损伤[27～29]。此模型的缺点：在较高的变形速率下，圆形板易造成不均匀变形；由于细胞需粘附在基材上，细胞的粘附性形变的验证就十分重要。

另一种得到广泛应用的是采用微流体装置建立模型，通过向柔性聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膜下方的气动通道施加气体压力，造成PDMS膜形变进而引起轴突拉伸损伤[30]。采用微流体装置模型的优势是可以检测损伤对神经细胞特定部分的影响，即可对神经细胞特定的区域(如胞体、轴突)进行精确损伤；而其不足之处是需要笨重的气动装置，设备仪器较为复杂[31]。

2 压力损伤模型

2.1 压力操作TBI动物模型

压力损伤TBI动物模型主要包括液压冲击伤(fluid percussion injury，FPI)模型和穿透性脑损伤(penetrating ballistic-like brain injury，PBBI)模型。

FPI模型是通过向颅腔内快速注入一定量的生理盐水造成脑组织的变形和移位，从而导致脑损伤，损伤程度取决于压力脉冲的强度。FPI模型可以复制人类TBI后颅内出血、脑肿胀和渐进性灰质损害等病理生理特点，主要用于复制临床无颅骨骨折的TBI[32～37]。根据颅骨钻孔位置的不同，FPI模型可以分为中央(矢状缝上)FPI模型、矢状窦旁(距中线<3.5 mm)FPI模型和侧方(距中线>3.5 mm)FPI(lateral fluid percussion injury，LFPI)模型。早期的FPI模型主要是通过控制钟摆下落的高度这一单一变量来控制损伤程度。为了提高可重复性，Kabadi等[38]开发了一种微处理器控制的气动装置，采用这种新型设备，冲击压力和停留时间均可得到精确控制以减少试验之间的差异。LFPI模型产生的认知功能障碍、神经行为障碍等是临床上TBI患者常见的症状。但是由于造成脑干损伤，呼吸暂停时间延长，FPI模型与其他模型相比具有较高的致死率。因此，大鼠LFPI模型中开颅手术部位的选择确定对损伤程度至关重要，建模时要精确控制开颅手术的位置，以提高模型的可靠性和重复性。

另一种模拟颅内压升高的模型是PBBI模型，其由高能量弹头和冲击波造成，这种冲击波在大脑中产生了数倍于弹丸本身尺寸的临时腔，而其损伤程度取决于弹射的路径和能量转移的程度。目前，已开发出多种新的PBBI啮齿动物模型。Davis等[39]将PBBI探针经由骨窗进入大脑右半球，进针深度为1.2 cm，由计算机程序控制，向探针内充水，使探针弹性头膨胀，产生1个椭圆形的水球，体积等于大脑体积的10%，球囊放水后，探头缩回，从而建立PBBI模型。大鼠PBBI模型会造成白质和灰质损伤、脑水肿、癫痫、皮层扩散、神经胶质细胞增生、神经炎症等，还会体现出由此造成的感觉障碍以及认知功能障碍的症状。与其他TBI模型相比，由于PBBI模型损伤的渗透性及其形成的暂时性腔，其在整个原发病灶中会引起广泛的脑内出血[11,40]。正是PBBI模型所具有的特点，使其对研究中度或重度颅脑损伤的机制具有重要意义。

2.2 压力损伤TBI细胞模型

压力损伤TBI细胞模型包括加压损伤(compression injury)神经细胞模型和负压引流损伤(vacuum assisted injury)神经细胞模型。

加压损伤神经细胞模型即通过向体外培养的细胞施加一定的压力从而造成细胞损伤，主要用于复制闭合性脑损伤或FPI模型。但为了获得细胞反应，增加的压力需远超过TBI期间发生的水平。在培养基产生的静水压力条件下，脑部变形可能非常小，因为脑组织几乎是不可压缩的，因此，需要更高的压力(15个大气压左右)才能造成损伤。陈翰博[41]将星形胶质细胞的培养盒与加压器连接并密封，注入氮氧混合气体，分别给予不同大小的压力，结果显示加压后细胞体积增大、水肿明显，且随着压力的增加，水肿更为明显。加压损伤模型与TBI后临床病理生理相似，且方法简单、条件易于控制，可通过调整压力值来控制损伤程度，主要用于中枢神经系统(central nervous system，CNS)中神经细胞机械性损伤的研究，也适用于TBI后各神经细胞继发性损伤的研究[42～44]。

负压引流损伤神经细胞模型是通过使用微流控装置和实验室真空来损伤轴突。一旦轴突生长至相邻隔室，采用巴斯德吸管在第二隔室入口真空抽吸，在第二隔室产生一个气泡，此气泡会对第二隔室的轴突产生剪切力，造成轴突损伤。因此，该装置会导致轴突损伤且不影响胞体，这种损伤方法随后被用于筛选潜在的轴突再生的治疗。基于微流体和真空的损伤机制也可用于模拟和表征急性轴索变性(acute axonal degeneration，AAD)[31]。Zhou等[45]使用微流体真空吸入损伤模型来研究损伤后观察到的成熟轴突再生减少的途径。在成熟轴突中，线粒体锚定蛋白(mitochondria-anchoring protein syntaphilin)SNPH阻碍线粒体运输，从而在损伤部位产生能量缺陷。通过敲除SNPH基因增强线粒体运输，通过增加线粒体转运和维持受损轴突的ATP供应促进了损伤后的轴突再生。因此，真空吸入损伤模型可以表征线粒体运输以及受损轴突的能量供应，并且能够为轴突再生提供新的治疗策略[31]。此模型的不足之处在于需要互相连接的隔室之间的高流体阻力以限制对特定神经元区域的伤害。该阻力通常由微流体装置中的微槽提供，因此，必须仔细调整真空的持续时间和强度以减少对非特定区域的损害。

3 爆炸伤模型

颅脑爆炸伤主要指的是由爆炸冲击波和投射物造成的颅脑损伤(blast-induced traumatic brain injury，bTBI)，是现代战争中的主要伤型。国内外学者针对bTBI建立了各种各样的模型，其中常用的有自由场爆炸模型、爆炸管模型、小型爆炸源模型、以及高级爆炸模拟器(advanced blast simulator，ABS)模型[46～49]。ABS模型无需使用炸药，而是以压缩气体作为动力。其结构为一圆柱形管，中间采用一种特殊材质的薄膜将圆柱形管分割为2个室，分别为加压区和测试区，当加压区气压上升到一定程度击破隔膜所产生的冲击波，会对放置于测试区的动物头部造成损伤。Rodriguez等[49]采用的激波管待测区长度为2 m、加压区长度为2.54 m、隔膜厚度为0.4 mm，将大鼠头部放于激波管待测区，通过将空气加压至1 230 kPa左右冲破隔膜产生冲击波，造成大鼠头部损伤，从而建立bTBI动物模型。ABS模型是目前bTBI研究领域中应用最多的模型，其优点主要是安全性高、可在室内操作，从而降低了外界的干扰；且可通过调节隔膜的材料，产生不同大小的冲击波[36,50～52]。但需要注意的是，ABS模型也有其自身的重要缺点：①气体驱动冲击波的物理特性可能不同于爆炸冲击波；②隔膜碎片可能对受试对象产生影响；③管出口附近产生的射流效应可能对受试对象产生影响[46]。

同样的，将培养的神经细胞以及脑组织切片放在激波管待测区，则可建立bTBI体外模型。Campos-Pires等[53]将小鼠海马脑片细胞面向激波管，分别采用不同冲击压力来建立创伤模型，并利用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色法检测细胞死亡水平。结果表明，爆炸伤的损伤程度随冲击压峰值和冲击波的增加而增加，且冲击波诱导的细胞死亡方式主要是细胞凋亡。

4 反复性轻度损伤模型

反复性轻度创伤性脑损伤(repeated mild traumatic brain injury)模型通常发生在需接触的运动(拳击、篮球、足球、橄榄球)及家暴等情况中[11,54]。越来越多的证据表明，反复脑震荡会导致行为异常和病理改变。目前已建立了多种反复性轻度创伤性脑损伤模型，如CCI模型、WD模型、FPI模型、Blast-TBI模型、cell stretch injury 模型[37,55～58]。研究表明，短时间内反复轻度TBI可以造成弥漫性轴索损伤和慢性神经炎，而这些病理生理现象与阿尔兹海默病、帕金森综合症等神经退行性疾病密切相关。由于轻度脑损伤往往被人们忽略，但反复性轻度创伤性脑损伤可能是灾难性或致命性的，因此，反复性轻度创伤性脑损伤模型对TBI后神经退行性疾病的研究具有重要意义。

综上所述，TBI模型的建立为研究相关发病机制、开发有效治疗方案奠定了基础。现将各模型的特点做一总结，具体见表1。

5 展望

尽管利用TBI模型开展脑损伤研究已取得了一定进展，但仍存在一些难以克服的不足。常用的TBI模型动物(特别是啮齿类动物)的大脑与人脑在生理学上存在一定程度的相似性，但在脑结构和功能方面仍存在显著差异，如在脑几何形状、颅角度、回旋复杂性、灰质与白质灰分比例等方面均存在差异，这对TBI模型的建立会产生不良影响[11,33]。许多TBI模型的研究并未严格测量TBI前后的生理变量，包括CO2分压、O2分压、pH、血压和脑温等，而这些变量在确定机体对损伤和治疗的病理生理反应中非常重要。此外，年龄、性别、物种对TBI结果也会产生影响[2,4,5,62～64]，需多加研究。而TBI体外模型的局限性主要表现在组织细胞可能在离体后产生有害的应激反应；其次，组织细胞在取材的过程中已经受到损伤，这在一定程度上可能对组织的实验性损伤产生影响。TBI体外模型需要重点解决的问题是减少细胞外环境(如血液、活化的巨噬细胞等)对神经细胞的影响，以及降低组织细胞在取材过程中造成的损伤[60,65,66]。有时，基于体内模型与体外模型的研究会产生相互矛盾的结果，但这并不意味着体外模型检测结果不准确，可能与环境(如炎症反应、温度调节、氧合和局部离子浓度)的差异有密切关系[11,47,59,61,65,67]。利用2种TBI模型进行研究各有利弊，因此，在研究一种新的治疗手段或药物时，应联合应用不同类型的TBI体内、体外模型，以模拟在损伤期间引起的不同病理生物学反应，采用这种交叉验证的方式，可使实验结果更为真实、可靠，减少假阳性结果的产生。

表1 常用TBI动物模型及细胞模型的特点Table 1 Characteristics of common-used TBI animal and cell models.