减压内部沸腾法提取荸荠皮黄酮的工艺优化

汪建红

(1.内江师范学院化学化工学院,四川内江 641119; 2.四川省高等学校“果类废弃物资源化”重点实验室,四川内江 641110)

荸荠是一种美味多汁的水果,具有抗肿瘤、清肺化痰、通肠利便等保健作用[1-2]。我国是荸荠的原产地,荸荠的生产和消费量较大,每年可产出百万吨以上的鲜荸荠,按照26%的含皮量来计算，每年可产生26万吨左右的荸荠皮。这些荸荠皮要么被直接丢弃,要么被当做饲料直接使用,其价值没得到充分发挥[3-6]。荸荠皮富含黄酮,黄酮是一种重要的生物活性成分,可消炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤等,广泛应用于食品药物等领域[7-10]。因此研究荸荠皮中黄酮的提取可大大提高其经济和实用价值,意义重大。

天然产物中有效成分的常用提取方法中,传统的乙醇浸提法[11-14]得率较低,且提取时间较长;酶法[12,15-17]提取时间较长,且后处理较复杂,酶易失活;超声波法[18-21]和微波法[22-25]得率较高,提取时间较短,但超声波对人体存在潜在风险,是潜在的致畸形因素,微波会对中枢神经系统和眼部带来损伤,并会使免疫功能下降,也会影响生殖机能。减压内部沸腾法是一种利用预先渗透入细胞组织内部的有机物在一定真空度下发生内部沸腾,从而加快活性成分解吸的方法[26-27]。内部沸腾法高效省时,得率较高,且操作简便，特别适用于热敏性、不稳定、易氧化等有效成分的提取[26-27]。内部沸腾法是目前的研究热点,但尚无使用此法提取荸荠皮黄酮的记载。

因此,本实验选择乙醇溶液为提取溶剂,采用减压内部沸腾法提取荸荠皮中的黄酮,并利用单因素实验和响应面试验优化提取条件,以期为荸荠皮以后的开发利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荸荠 内江东兴区农贸市场;芸香苷标准品(UC≥98%) 上海纪宁试剂有限公司;乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(分析纯) 成都金山化学试剂有限公司。

DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;DFT-100手提式万能高速粉碎机 温岭市林大机械有限公司;BSA822赛多利斯电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州英峪予华仪器有限公司;TDL-5-A低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂;SHA-B恒温水浴振荡器 金坛市汉康电子有限公司;T-6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;SHB-B95水循环多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 按照汪建红等[28]的方法,称取20.00 g芸香苷标准品,利用30%乙醇配制成0.20 mg/mL的标准溶液,再将此标准溶液分别稀释配制成0.008、0.016、0.024、0.032、0.040、0.048 mg/mL的标准溶液,然后先后利用5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液和1 mol/L的氢氧化钠溶液对不同浓度的标准溶液进行显色,显色后再在510 nm波长处测定其吸光度值,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制黄酮标准曲线,并得出其在8.000～48.000 μg/mL之间的线性回归方程为A=0.0146C-0.0053,R2=0.9992。

1.2.2 荸荠皮中黄酮的提取和测定 将市场购买的荸荠取皮,然后洗净荸荠皮,低温烘干,并粉碎成粉。参考文献蔡锦源等[26]、乐薇等[27]的方法,称取1.00 g荸荠皮粉末置于100 mL圆底烧瓶中,加入5 mL 95%乙醇,常温下浸泡30 min,然后迅速加入一定量已经加热到一定温度的一定浓度的乙醇水溶液,装上装置,启动真空泵抽真空,水浴下在38 kPa左右压力下真空回流一定时间,然后停止加热,移去真空。待冷却后,在1500 r/min的速度下离心10 min获取上清液。将上清液转入50 mL容量瓶中,用30%乙醇溶液定容,得到荸荠皮黄酮提取液。

准确移取1.00 mL上述提取液转入25 mL比色管中,依次向其中加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液、1 mL 10%硝酸铝溶液和6 mL 1 mol/L的氢氧化钠溶液,每加入一种试剂后需摇匀,并静置6 min后再加入下一种试剂。再向其中加入30%乙醇溶液稀释到10 mL,摇匀,静置15 min。然后利用紫外-可见分光光度计在510 nm波长处测定其吸光度值,根据标准曲线获得其黄酮浓度,然后利用公式(1)计算荸荠皮中黄酮的得率。

黄酮得率(%)=(稀释后黄酮浓度×稀释倍数×提取液体积/荸荠皮粉质量)×100

式(1)

1.2.3 乙醇浓度的影响 固定乙醇和荸荠皮粉末的液料比、提取温度和提取时间分别为15∶1 mL/g、50 ℃和20 min,研究乙醇体积浓度(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)对黄酮得率的影响。

1.2.4 液料比的影响 在将乙醇浓度固定为上一步实验确定的值,提取温度、提取时间分别固定为50 ℃和20 min的条件下,研究液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g)对黄酮得率的影响。

1.2.5 提取温度的影响 在将乙醇浓度、液料比分别固定为前面步骤确定的值,提取时间固定为20 min的条件下,研究提取温度(40、50、60、70、80、90 ℃)对黄酮得率的影响。

1.2.6 提取时间的影响 在将乙醇浓度、液料比和提取温度分别固定为前面步骤确定的值的条件下,研究提取时间(10、20、30、40、50 min)对黄酮得率的影响。

1.2.7 响应面试验 根据单因素实验的结果,选择三个影响显著的因素为自变量,分别记为A、B、C,每个因素3个水平,采用Box-Behnken设计法设计响应面试验。该响应面试验的因素水平表如表1所示。

表1 响应面试验的因素与水平Table 1 Factors and levels in response surface experiment

1.3 数据处理

本实验每组实验条件做三次平行实验,并取其平均值。对每个单因素实验结果采用Origin 75绘图软件绘制曲线,并以此曲线研究并分析各单因素对黄酮得率的影响。在单因素实验的基础上采用Box-Behnken设计响应面模型,采用Design Expert 8.0 软件分析并处理响应面试验结果,得出最佳提取工艺条件和因素影响大小顺序。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对荸荠皮黄酮提取效果的影响 乙醇浓度对荸荠皮黄酮得率的影响如图1所示。从图1中可看到,随乙醇浓度增大,黄酮得率的变化趋势为先逐渐增大后逐渐减小,在乙醇体积浓度为60%时出现最大值1.340%。这是由于乙醇浓度过小时,会使预先浸泡时渗透入荸荠皮内部的乙醇被稀释,导致内部沸腾不够剧烈,甚至不发生内部沸腾,对黄酮从细胞壁上的解吸造成不利;乙醇浓度过大时,内部沸腾较为剧烈,会导致短时间内有大量的提取物及乙醇溶解的大量脂溶性杂质通过内外对流的孔隙进入溶液中,易造成孔隙的堵塞,影响黄酮提取[26-27]。因此,最佳乙醇体积浓度为60%。

图1 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.1 Influence of ethanol concentration on the yield of flavonoid

2.1.2 液料比对荸荠皮黄酮提取效果的影响 液料比对荸荠皮黄酮得率的影响如图2所示。从图2可看到,随溶剂用量增加,黄酮得率逐渐增大,在35∶1 mL/g时达最大值1.768%;当液料比大于35∶1 mL/g后黄酮得率没出现明显变化,甚至略有下降。这是由于溶剂越多,能溶解的黄酮越多;但由于选做溶剂的乙醇浓度小于预先进入荸荠皮内部的乙醇浓度,溶剂增多会导致已预先进入荸荠皮组织内部的乙醇被逐渐稀释,使内部沸腾引起的对流被削弱,影响黄酮解吸[26-28]。因此,选择最佳液料比为35∶1 mL/g。

图2 液料比对黄酮得率的影响Fig.2 Influence of liquid-solid on the yield of flavonoid

2.1.3 提取温度对荸荠皮黄酮提取效果的影响 提取温度对荸荠皮黄酮得率的影响如图3所示。从图3可看到,提取温度的上升导致黄酮得率先逐渐上升后逐渐下降,且在70 ℃时达最大值2.022%。这是由于提取温度越高内部沸腾越剧烈,有利于黄酮从荸荠皮上解吸;但内部沸腾过于剧烈时,也会造成短时间内大量提取物和溶解的脂溶性杂质通过对流孔隙,易堵塞荸荠皮内外对流的孔隙,影响黄酮的溶解析出[26-27]。因此,最佳提取温度为70 ℃。

图3 温度对黄酮得率的影响Fig.3 Influence of temperature on the yield of flavonoid

2.1.4 提取时间对荸荠皮黄酮提取效果的影响 提取时间对荸荠皮黄酮得率的影响如图4所示。从图4可看到,随时间的延长,黄酮得率先逐渐增大,在20 min达到最高点2.022%后,又逐渐下降。这是由于荸荠皮内外黄酮浓度差异较大,时间的延长会使更多的黄酮从荸荠皮解吸转移到溶液中,但时间的延长也会导致更多的溶剂乙醇在减压下被真空泵带走,使部分已溶解析出黄酮重新固化,另外,时间的增加也会导致更多的进入溶液中的黄酮在加热下分解变质[26-27]。因此,最佳提取时间为20 min。

图4 提取时间对黄酮得率的影响Fig.4 Influence of extraction time on the yield of flavonoid

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据单因素实验的结果,考虑到各因素对荸荠皮多糖得率影响的显著情况,选择固定液料比在35∶1 mL/g的条件下,以乙醇浓度、提取温度、提取时间三个因素为自变量,分别记为A、B、C,以黄酮得率(R)为响应值,响应面试验方案及结果如表2所示。

根据表2中数据,利用Design Expert 8.0软件拟合的二次多项回归方程为:

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiment

R=1.97+0.023A+0.042B+0.024C+0.017AB-0.098AC+0.019BC-0.037A2-0.060B2-0.031C2

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.2.3 交互作用分析 各因素间交互作用的响应面图及等高线如图5～图7所示。从图5～图7也可看到,等高线均不是圆形,而是近似于椭圆形和非规整形状,且与图形两柱之间形成一定角度,说明乙醇浓度和温度、乙醇浓度和时间及温度和时间之间的交互作用均显著,与方差分析结果一致。

图5 乙醇浓度、温度交互作用的等高线和响应面图Fig.5 Contour plot and response surface plot of interaction between ethanol concentration and temperature

图6 乙醇浓度、时间交互作用的等高线和响应面图Fig.6 Contour plot and response surface plot of interaction between ethanol concentration and time

图7 温度、时间交互作用的等高线和响应面图Fig.7 Contour plot and response surface plot of interaction between temperature and time

2.2.4 验证试验 根据Design Expert 8.0软件对所得到的模型的优化分析,得出黄酮提取的最优提取条件为:乙醇浓度50.77%,温度73.71 ℃,时间30 min,此时黄酮得率理论上为2.011%。考虑到实验室的具体条件,将该最佳提取条件修正为:乙醇浓度50%,温度70 ℃,时间30 min,在此最佳条件下进行5次平行实验,黄酮得率为1.996%±0.010%,与理论预测值2.001%的相对误差为0.25%。此结果接近于预测值,说明该模型是可靠的,适合于荸荠皮黄酮的提取工艺优化。

3 结论

本实验以乙醇溶液为溶剂,采用减压内部沸腾法提取荸荠皮中黄酮,并利用单因素实验和响应面实验优化提取条件,得出最佳提取条件为:液料比35∶1 mL/g,乙醇浓度50%,温度70 ℃,时间30 min,此条件下平行实验的黄酮得率为1.996%±0.010%,与理论预测值2.001%的相对误差为0.25%,说明结果是准确的,模型是可靠的。温度、时间、乙醇浓度三因素影响的先后顺序为:温度>时间>乙醇浓度。减压内部沸腾法提取荸荠皮黄酮高效省时,对荸荠皮黄酮的提取研究有一定的实际意义。