越橘提取物中花青素分析及其体外抗氧化活性

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(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院,教育部食品营养与安全重点实验室,天津 300457; 2.天津食品安全低碳制造协同创新中心,天津 300457;3.天津科技大学新农村发展研究院,天津 300457)

越橘(Vacciniumvitis-idaeaLinn.),是杜鹃花科植物,原产于北美地区。目前,越橘在我国的东北及内蒙古地区分布广泛[1]。越橘含有丰富的生物活性成分,包括膳食纤维和多酚。据报道,富含多酚的越橘可以减少蓝光诱导的小鼠的视网膜损伤[2]。越橘还具有抗氧化活性和酶抑制特性以及抗炎作用[3-4]。如今,越橘常用来制作饮料和酿酒,也用做食品中的着色剂[5]。除此之外,越橘还具有药用价值,被归类为功能性食品。越橘提取物是以成熟的越橘果实或加工残渣为原料提取得到的黑紫色粉末,其中花青素含量较高。越橘提取物功效优良、应用范围广、副作用低,如今已广泛应用于食品与药品中[6]。

花青素属于黄酮类化合物,是自然界广泛存在的一类水溶性天然色素,广泛存在于蓝紫色果蔬中[7]。已有研究表明,花青素具有缓解视觉疲劳、改善动物和人的视力、抗突变、抗肿瘤和神经保护作用[8-14]。自然条件下很少有游离的花青素,其通常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷形成花色苷,存在于植物中的花青素主要有6种:矢车菊素、飞燕草素、矮牵牛素、天竺葵素、芍药素和锦葵素[15]。已有研究表明,越橘中花青素主要为锦葵素、飞燕草素、矢车菊素、矮牵牛素、芍药素五种[16]。目前,主要使用液质联用法对花青素的各组分进行鉴定。Tian等[17]通过液相色谱-质谱联用对越橘中花青素进行分离与鉴定,发现越橘中有矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷等。

本研究使用液相色谱与质谱联用的方法对越橘提取物中的花青素进行组分鉴定,并以矢车菊素-3-葡萄糖苷为标准品,测定各组分的含量。同时对越橘提取物进行了DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羟基自由基清除能力和还原力的抗氧化活性分析,为越橘提取物的开发利用提供一定理论与数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

越橘提取物 尖峰天然产物有限公司;矢车菊素-3-葡萄糖苷标准品 纯度>98%,USP(美国药典);甲醇、乙腈、甲酸 均为色谱纯;水 超纯水;2,2′-联氨-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate),ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美国Sigma公司;其他试剂 分析纯。

Ultimate 3000 高效液相系统 美国安捷伦公司;amaZon SL离子阱质谱仪 美国Bruker公司;A20高效液相系统 日本岛津公司;EX125DZH电子天平 奥豪斯仪器(常州)有限公司;Milli-RO Plus超纯水仪 美国Millipore公司;XC-3200DT超声清洗机 天津欧诺仪器仪表有限公司;Thermo-C18固相萃取小柱、3020-679酶标仪 美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 越橘提取物中花青素的组成及含量分析

1.2.1.1 越橘提取物的纯化 精密称取越橘提取物10 mg(精确至0.01 mg),置于 10 mL容量瓶中,用 2%盐酸-甲醇溶解并定容至刻度,得到浓度为1 mg/mL的越橘提取物溶液。

Thermo-C18固相萃取小柱先分别用5 mL甲醇溶液和5 mL水溶液清洗活化,然后加入1 mL样品溶液,抽真空至液体流尽,再用5 mL甲醇溶液洗脱,收集甲醇洗脱液。将收集的甲醇洗脱液进行氮吹至甲醇完全吹干,用2%盐酸-甲醇溶液复溶至1 mL,以备液质测定。

1.2.1.2 标准品溶液的配制 精密称取定量矢车菊素-3-葡萄糖苷标准品(精确至0.01 mg)10 mg,置于10 mL容量瓶中,用2%盐酸-甲醇溶解并定容至刻度,得到浓度为1 mg/mL的矢车菊素-3-葡萄糖苷标准品溶液,避光保存。

1.2.1.3 液相色谱及质谱条件 根据预实验结果,高效液相色谱测定条件为:Ultimate 3000高效液相色谱仪,配紫外检测器;色谱柱:C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A:3%甲酸水溶液;流动相B:3%甲酸乙腈;梯度洗脱程序:0～35 min,7%～25% B;35～45 min,25%～65% B;45～46 min,65%～100% B;46～50 min,100% B;50～51 min,100%～7% B;51～60 min,7% B;柱温:35 ℃;进样量:20 μL;检测波长:530 nm。

质谱条件:正离子模式,全自动二级质谱扫描,扫描范围m/z 0～1000;雾化器压力30 Psi;干燥气(N2)流速8 L/min;温度230 ℃;毛细管电压3500 V。

1.2.2 越橘提取物的抗氧化能力

1.2.2.1 DPPH自由基清除能力 称取0.1984 g DPPH用无水甲醇溶解并定容至50 mL,配制成0.1 mmol/L的DPPH储备液,越橘提取物用无水甲醇分别配制成10、20、30、40、50 μg/mL的越橘提取物溶液,准确吸取不同浓度的1 mL越橘提取物溶液分别加入到3 mL 0.1 mmol/L的DPPH储备液中,室温避光30 min。以去离子水为参比溶液,VC为对照,每组设置3个平行,在517 nm下测定吸光度,根据式(1)计算DPPH自由基清除率,并计算IC50,IC50越小,表示清除能力越强[18]。

式(1)

式中:A0:空白对照的吸光度值;Ai:加入样品后的吸光度值;Aj:样品本身的吸光度值。

1.2.2.2 ABTS自由基清除能力 配制ABTS储备液:10 mL 7 mmol/L的ABTS溶液和440 μL 140 mmol/L过硫酸钾混合,在室温、避光条件下放置12～16 h,作为ABTS储备液。用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)将储备液稀释至使其在734 nm处的吸光值为0.70±0.02。越橘提取物用无水甲醇分别配制为10、20、30、40、50 μg/mL的越橘提取物溶液。

测定方法:准确吸取不同浓度的1 mL越橘提取物溶液分别加入到4 mL ABTS溶液中,在30 ℃水浴中反应6 min。以去离子水为参比溶液,以VC为对照,每组分别设置3个平行,在734 nm处测定吸光值,根据式(2)计算ABTS自由基清除率,并计算IC50,IC50越小,表示清除能力越强[19]。

式(2)

式中:A0:空白对照的吸光度值;Ai:加入样品后的吸光度值;Aj:样品本身的吸光度值。

1.2.2.3 羟基自由基的清除能力 越橘提取物用无水甲醇配制成0.2、0.5、1.0、2.0及4.0 mg/mL的越橘提取物溶液。准确吸取不同浓度的越橘提取物溶液各1 mL,依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水杨酸溶液和1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液,充分摇匀,在37 ℃水浴中反应30 min,以去离子水为参比溶液,以VC为对照,每组分别设置3个平行,在510 nm测定吸光值,根据式(3)计算羟基自由基清除率,并计算IC50,IC50越小,表示清除能力越强[20]。

式(3)

式中:A0:空白对照的吸光度值;Ai:加入样品后的吸光度值;Aj:样品本身的吸光度值。

1.2.2.4 还原力的测定 越橘提取物用无水甲醇配制成0、50、100、150、200及250 μg/mL的样品溶液。准确吸取不同浓度的越橘提取物溶液1 mL,依次加入磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L,pH6.6)2.5 mL和1%铁氰化钾溶液2.5 mL,充分混匀,在50 ℃水浴中反应30 min,快速冷却,加入10%三氯乙酸2.5 mL,充分混匀,加入2.5 mL蒸馏水和0.1%三氯化铁溶液0.5 mL,充分摇匀,反应10 min。以去离子水为参比,以VC为对照,在700 nm下测定吸光度值。还原力的大小用吸光度值来表示,吸光度值越大,表示还原力越强[21]。

1.3 数据处理

数据以平均值±标准差的形式呈现,每个数据有三个重复,数据统计分析采用Excel 2016和SPSS 20.0软件,采用Origin 9.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 越橘提取物中花青素的组成及含量分析

2.1.1 越橘提取物中花青素的组成分析 通过HPLC-MS/MS对越橘提取物中花青素的组成进行分析鉴定,得到液相色谱图,见图1。对色谱图中的有效峰进行质谱分析得到含有不同质荷比的分子离子峰和碎片离子峰,获得化合物的分子量信息,并与文献报道的组分相比较,推测出花青素组分,本文鉴定出越橘提取物中共有14种花青素,见表1。

表1 越橘提取物花青素分析Table 1 Anthocyanin analysis of bilberry extract

由图1可以看出,越橘提取物中共检测出14个花青素主峰,结合表1中的分子量可以发现越橘提取物含有5种花青素:飞燕草素(m/z 303),矢车菊素(m/z 287),矮牵牛素(m/z 317),芍药素(m/z 301)和锦葵素(m/z 331)。

图1 越橘提取物的液相色谱图Fig.1 HPLC of bilberry extract

峰1和峰2具有相同的一级质谱离子峰m/z 465和二级质谱离子峰MS/MS=m/z 303,其二级质谱具有明显的离子峰m/z 303,故可判断其为飞燕草素衍生物。m/z 465与碎片离子峰m/z 303相差162,为飞燕草素丢失的中性碎片,其可以是葡萄糖苷或半乳糖苷。根据文献报道[22-24]和两种糖苷的洗脱顺序为半乳糖苷比葡萄糖苷更早洗脱,因此可确定峰1为飞燕草素-3-O-半乳糖苷,峰2为飞燕草素-3-O-葡萄糖苷。同理,可以推测峰3为矢车菊素-3-O-半乳糖苷,峰5为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷,峰6为矮牵牛素-3-O-半乳糖苷,峰8为矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷,峰9为芍药素-3-O-半乳糖苷,峰11为芍药素-3-O-葡萄糖苷。

峰4的一级质谱离子峰m/z 435和二级质谱离子峰MS/MS=m/z 303,可判断为飞燕草素衍生物。m/z 435与碎片离子峰m/z 303相差132,表示丢失一个阿拉伯糖苷[25],因此可判断峰4为飞燕草素-3-O-阿拉伯糖苷。同理,峰7为矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷。

由峰10的一级质谱离子峰m/z 303,可推断其为游离的飞燕草素。峰14的一级质谱离子峰m/z 287,可判断其为矢车菊素。

峰13的一级质谱离子峰m/z 463,其二级质谱离子峰MS/MS=m/z 331,其二级质谱具有明显的离子峰m/z 331,可判断其为锦葵素类花青素,162表示母离子丢失一个葡萄糖苷,结合参考文献[16]可确定峰13为锦葵素-3-O-阿拉伯糖苷。

2.1.2 越橘提取物中花青素的含量分析

2.1.2.1 标准曲线的确定 分别配制浓度为2、5、10、25、50、100 μg/mL的矢车菊素-3-葡萄糖苷标准溶液,按照1.2.1.3中色谱条件进行测定。以矢车菊素-3-葡萄糖苷质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得到其峰面积与浓度有良好的线性关系,回归方程y=58286x+67727,R2=0.9995。

2.1.2.2 精密度实验 将质量浓度为100 μg/mL的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品按照1.2.1.3中色谱条件进行测定,重复进样6次,测得色谱峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.57%,表明在该色谱条件下精密度良好。

2.1.2.3 重复性实验 取越橘提取物6份,按照1.2.1方法处理并进行测定,测得越橘提取物中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的RSD为2.73%,表明该方法重复性较好。

2.1.2.4 加样回收率实验 在已知含量的越橘提取物溶液中分别加入矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品(5、10、25 μg/mL),连续进样三次,每次20 μL。加样回收率实验结果表明:矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的平均回收率为99.14%,RSD为0.95%,表明该方法具有较高的加样回收率。

2.1.2.5 越橘提取物中花青素的含量测定 以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为标品,对越橘提取物的花青素进行定量分析。通过对同一化合物不同的异构体的峰面积加合起来进行总量的计算,结果表示为均值±SD μg(矢车菊素-3-葡萄糖苷当量)/mg(越橘提取物)[26]。花青素各组分的含量见表2。

表2 越橘提取物中花青素各组分的含量Table 2 Content of anthocyanins in bilberry extract

经计算,越橘提取物中花青素的总含量为408.74 μg/mg。其中,矢车菊素类花青素含量最高,为159.93 μg/mg,占总含量的39.12%。

2.2 越橘提取物的抗氧化能力分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力 越橘提取物和VC的DPPH自由基清除能力的测定结果,如图2所示。在浓度为10～50 μg/mL范围内,越橘提取物的DPPH自由基清除率从22.26%增加到了86.09%。在每个浓度下,越橘提取物的DPPH自由基清除率都低于VC的,VC的浓度为20 μg/mL时,DPPH清除率就达到95%以上,并且在之后趋于平稳。经计算,越橘提取物和VC的DPPH清除率的IC50分别为26.16和7.35 μg/mL。根据IC50可知越橘提取物有良好的DPPH清除能力,但相对于VC较弱。

图2 越橘提取物和VC的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH free radical scavenging ability of bilberry extract and VC

2.2.2 ABTS自由基清除能力 越橘提取物和VC的ABTS自由基清除能力的测定结果,如图3所示。随着样品质量浓度的增加,越橘提取物和VC的ABTS自由基清除率都呈现增长的趋势。在相同的质量浓度下,越橘提取物清除ABTS自由基的能力强于VC。当浓度达到30 μg/mL时,越橘提取物和VC的ABTS自由基清除率都达到90%以上,并且在之后趋于平稳,并接近100%。经计算,越橘提取物和VC的ABTS自由基清除率的IC50分别为13.07和15.55 μg/mL。根据IC50可知,越橘提取物有强于VC的ABTS自由基清除能力。

图3 越橘提取物和VC的ABTS+自由基清除能力Fig.3 ABTS free radical scavenging ability of bilberry extract and VC

2.2.3 羟基自由基清除能力 羟基自由基(·OH)是活性氧类物质中化学性质最活泼的一种自由基,其在自由基病理学上具有高度损伤性,它的损伤能力几乎在每一个活细胞内都能发生,是危害最大一种最大的自由基[27]。越橘提取物和VC清除羟基自由基的结果见图4。如图4所示,在实验浓度范围内,越橘提取物的羟基自由基清除率随浓度的增加而增加,清除率从15.43%增加到90.27%。同时,VC在浓度为1.0 mg/mL时,清除率就达到99%,并且在之后接近100%。经计算,越橘提取物和VC的羟基自由基清除率的IC50分别为1.91和0.48 mg/mL。根据IC50可知,越橘提取物有较强的羟基自由基清除能力,但是相对于VC较弱。

图4 越橘提取物和VC的羟基自由基清除能力Fig.4 Hydroxyl free radical scavenging ability of bilberry extract and VC

2.2.4 还原力 常用还原铁氰化钾的方法来测定还原力的大小,抗氧化剂可以将Fe3+还原成Fe2+,测定700 nm处的吸光度值可以反映Fe2+数量,来代表还原力的大小[28]。越橘提取物和VC的还原力如图5所示。由图5可知,越橘提取物和VC的还原能力都随浓度增大而增大。在实验浓度范围内,越橘提取物的还原力从0.043增加到0.617,而VC对照的还原力从0.043增加到1.162,且在相同浓度下,越橘提取物的还原力低于VC。

图5 越橘提取物和VC的还原力Fig.5 The reducing power of bilberry extract and VC

3 结论

本文通过HPLC-MS/MS鉴定出越橘提取物中含有14种花青素,分别为飞燕草素-3-O-半乳糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、飞燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖、矮牵牛素-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-半乳糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷、锦葵素-3-O-阿拉伯糖苷、锦葵素-3-O-阿拉伯糖苷、飞燕草素和矢车菊素。以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为标品,得到越橘提取物中总花青素含量为408.74 μg/mg。体外抗氧化活性实验结果表明,越橘提取物有良好的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和还原力,但相比于VC较弱,其ABTS自由基清除能力强于VC。本研究可以为进一步开发越橘类功能性产品提供实验依据。