白果越橘组织培养和快速繁殖技术研究

毕海林，杨正松,2，杨洪涛，黄杏娥，和志娇，木永青，和加卫*

(1.云南省农业科学院 高山经济植物研究所，云南 丽江 674199;2.丽江蓝玛生物科技开发有限责任公司，云南 丽江 674199)

白果越橘(VacciniumleucobotrysNutt.)，是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)的一种常绿灌木。越橘属约有450种，分布北半球温带、亚热带，美洲和亚洲的热带山区。我国已知91种、24变种、2亚种，主产分布在西南和华南地区，云南省已知的越橘属植物有45种、12变种[1]。白果越橘通常附生，高0.5～1.0 m，果实球形或略扁，绿色至雪白色，果梗红色，棒状，花期3～4月，果期5～8月，分布于中国云南(贡山、碧江、沪水)、西藏(墨脱)，也分布于不丹、印度(阿萨姆)和缅甸(东北部)，生长于海拔2100～2800 m的常绿阔叶林中，附生树上或岩石上[2]。越橘属果实基本为蓝果类型，极少数为红果类型，如红豆越橘(Vacciniumvitis-idaea)、蔓越橘(Oxycoccos)、红果越橘(VacciniumhirtumThunb.)和红莓苔子(VacciniumoxycoccosLinn.)等，目前培育成的红果类型越橘栽培品种为红粉佳人。越橘属白果类型仅为白果越橘，其果实雪白色，晶莹剔透，果实不但营养价值高，而且十分漂亮，具有较高的观赏价值。白果越橘果实极具特色，因此可在越橘育种工作中发挥极重要的应用价值。

目前，国内外对白果越橘的研究仅限于野生资源分布及其生物学性状等，白果越橘资源收集及评价、引种驯化、嫁接、根瘤及其菌根真菌、种苗繁育技术等方面的研究还需要进一步加强，以此对我国的白果越橘种质资源进行合理开发利用。研究白果越橘种苗快速繁育技术，对保存我国的越橘种质资源和合理开发利用将发挥重要作用。近年来，越橘栽培品种组织培养育苗技术在我国已经比较成熟。刘庆忠[3]、李丽容[4]、张长青[5]、朱忠荣[6]、余强波[7]、刘捷[8]等对兔眼蓝莓和高丛蓝莓进行了组织培养技术研究。和加卫等[9]对野生越橘云南越橘进行了组织培养研究，而白果越橘的组培快繁技术尚未见报道。本文对白果越橘进行了组织培养技术研究，摸索出了白果越橘组织培养快速繁殖技术，为下一步白果越橘资源的开发利用奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

白果越橘(VacciniumleucobotrysNutt.)的果实、种子及植株枝条取自云南省丽江高山植物园资源圃。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒及初代培养 以白果越橘成熟果实内带果肉的新鲜种子、干种子、嫩枝条茎段作为外植体。8月中旬取白果越橘成熟果实和枝条进行处理，干种子为成熟果实中洗出并晾干的当年种子。外植体消毒和接种:以成熟果实为消毒材料，将带果肉的种子作为外植体；以用水浸泡2 d的种子为外植体；以带1～2个腋芽的嫩茎段为外植体；将果实、种子、茎段均用洗衣粉液浸泡5 min，流水冲洗2 h，然后放入超净台，70%乙醇消毒30 s，再用0.1%升汞溶液分别消毒15、6和10 min，无菌水浸洗5次后供接种使用；将消毒后的果实去除果皮，将内部带着果肉的种子和茎段直接接种在以下4种培养基上。4种诱导培养基分别为:MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L ZT、WPM+1.0 mg/L ZT，培养温度为25 ℃,光照强度为2000 lx,光照时间为12 h/d，培养基pH为5.4。1个果实接种5瓶培养基，1瓶培养基接种1粒种子，1瓶培养基接种1个茎段，以12个果实、60粒种子、60个茎段为1个组合，分别重复3次，60 d以后进行统计及分析。

1.2.2 继代增殖培养 培养基均为WPM培养基。将初代培养萌发的种子苗和腋芽剪成1 cm的茎段，接种到含不同激素的8种增殖培养基上。增殖培养基见表2,培养基pH为5.4。每瓶接10个茎段，3瓶作为一个观察组合，60 d后观察苗的生长情况及统计增殖系数；将培养基pH值分别设定为4.2、4.6、5.0、5.4、5.8，培养基中激素均为ZT，浓度为0.5 mg/L，每种pH值接种3瓶，每瓶接10个茎段，每个茎段长1 cm左右，60 d后测量苗的长度及统计增殖系数。

1.2.3 生根培养及试管外扦插 将试管苗剪去基部愈伤组织，蘸1000 mg/L NAA后分别扦插在松针粉、苔藓、草炭土和细腐殖土4种基质中，基质分别盛放在70孔穴盘中，每种基质观察3个穴盘，扦插以后放入大棚内，观察生根情况。

2 结果与分析

2.1 不同白果越橘外植体初代培养生长情况

由表1可以看出，白果越橘成熟果实中带果肉的种子、干种子和植株嫩茎段用0.1%升汞溶液分别消毒15、6、10 min后，污染率均较低。成熟果实中带果肉的种子在培养基上2～3 d就开始膨大，5 d就开始萌发，萌发很快，且萌发率很高，除极细小的不饱满种子外基本都能萌发；而浸泡的干种子萌发较慢，萌发率也较低，有些种子一直不萌发，种皮变褐，说明消毒剂对种子造成了伤害，而且干种子经过储藏后活力也有所降低；茎段在不同种类培养基上腋芽的萌发时间差别较大，WPM培养基上腋芽萌发较快，MS培养基上腋芽萌发较慢，而2种培养基上腋芽萌发率倒是差异不大。成熟果实中带果肉的种子、干种子和茎段在4种培养基上苗的生长速度差异相当明显，WPM培养基上苗生长较快，MS培养基上苗生长较慢，加有玉米素ZT的培养基中苗的生长速度明显比加有6-BA和NAA的培养基快得多。由此说明，加有玉米素ZT的WPM培养基有利于白果越橘种子实生苗及茎段腋芽的生长。

另外，白果越橘种子萌发后，在茎的基部有椭圆形淡绿色的组织形成，在实生苗生长发育过程中逐渐变成淡黄红色，并在相当长一段时期内仍然存在，这种椭圆形组织在发育过程中的变化有待进一步观察。该椭圆形组织可能是白果越橘的根瘤，需要进一步进行成分分析及鉴定。

2.2 白果越橘在不同条件下继代增殖培养

2.2.1 不同激素配比对白果越橘增殖的影响 由表2可以看出，培养60 d后，不同浓度的6-BA和NAA对白果越橘的增殖影响均不明显，白果越橘试管苗生长缓慢，长高较少，有黄绿色愈伤组织形成，但愈伤组织不分化形成丛生芽，说明6-BA和NAA对白果越橘的增殖效果不显著。而加有玉米素ZT的培养基中，苗生长较好，增殖系数均较高，ZT浓度较低时，试管苗较高，基本上都是单苗，极少形成丛生苗，随着ZT浓度增高，有较多的苗形成丛生苗，并且随着培养代数的增加，试管苗逐渐细弱。综合来看，WPM+0.5 mg/L ZT更有利于白果越橘的长期增殖及生根培养。

表1 3种白果越橘外植体初代培养生长情况

表2 白果越橘在不同激素配比条件下的增殖情况

2.2.2 不同pH值对白果越橘增殖的影响 由表3可以看出，不同pH值对白果越橘增殖影响极大。在试验过程中，pH值为4.2时，每升培养基需要加入大量琼脂粉培养基才能凝固，且培养基颜色不透亮，几乎没有弹性，增殖60 d后，苗几乎没有长高，苗几乎没有什么变化。pH值为4.6时，每升培养基也需要加入大量琼脂粉培养基才能凝固，培养基颜色不透亮，几乎没有弹性，增殖60 d后，苗长高较少。pH值为5.0时，每升培养基需要加入较多琼脂粉培养基才能凝固，且培养基颜色较透亮，稍有弹性，增殖60 d后，苗长高较多，部分苗基部形成2个丛生芽。当pH值为5.4时，每升培养基加入较少琼脂粉培养基就能凝固，且培养基颜色透亮，很有弹性，增殖60 d后，苗长高最多，部分苗基部形成2～3个丛生芽，增殖系数最高。pH值为5.8时，每升培养基加入少量琼脂粉培养基就能凝固，且培养基颜色很透亮，有弹性，增殖60 d后，苗长高较多，部分苗基部也形成2个丛生芽。综上所述，较高的pH值有利于白果越橘的增殖，培养基pH值为5.4时，试管苗增殖系数最高，白果越橘的增殖效果最好。

2.3 不同基质对白果越橘试管苗瓶外扦插生根的影响

蓝莓组培苗在试管内生根效果不佳，生根慢，生根率仅为30%～70%，因此主要采用试管外生根方法[10]。因此，本试验没有对白果越橘进行试管内生根培养，而是直接进行试管外扦插生根试验。

表3 白果越橘在不同pH值培养基中的增殖情况

由表4可以看出，白果越橘试管苗扦插在4种基质中的生根情况均较好。苔藓和草炭土13 d左右后多数枝段基部均形成少量愈伤组织，愈伤组织及其稍上方冒出数目不一的无色短根，一段时间后根变白，再变黄，60 d后统计观察发现，绝大多数枝段均长根，生根率达到95%左右，且根基本长满整孔基质，草炭土中的苗长高较多，苔藓中的苗长高较少；细腐殖土为基质的穴盘中，15 d后多数枝段基部也形成少量愈伤组织，愈伤组织及其稍上方冒出数目不一的无色短根，一段时间后根变白，再变黄，60 d后统计观察发现，绝大多数枝段均长根，生根率达到91%左右，根基本长满整孔基质，苗长高很多；松针粉为基质的穴盘中，约16 d后多数枝段基部也形成少量愈伤组织，愈伤组织及其稍上方冒出数目不一的无色短根，一段时间后根变白，再变黄，60 d后统计观察发现，绝大多数枝段均长根，生根率稍低，为87%左右，苗长高也较少。由此可见，苔藓、草炭土和细腐殖土均可作为白果越橘试管苗瓶外生根的基质。

表4 白果越橘试管苗在4种基质中的生根情况

3 讨论与结论

越橘属白果类型仅为白果越橘，果实极具特色，具有较高的观赏价值，在越橘育种工作中具有极重要的应用价值。研究白果越橘组织培养快速繁殖技术，对保存我国的越橘种质资源和合理开发利用将发挥重要作用。

组织培养育苗方法已在蓝莓生产上获得成功并成为我国目前蓝莓育苗的一种主要方式。应用组培方法繁殖速度快，结合日光温室等可以不受季节限制，并有利于苗木的生长，适宜于优良品种的快速扩繁。蓝莓组培苗在试管内生根效果不佳，生根慢，生根率仅为30%～70%，因此主要采用试管外生根方法[10]。目前，蓝莓生根扦插基质主要为苔藓和草炭土，一般在扦插13 d后就开始生根，生根效果好，生根率高。

本试验尝试用2种新的扦插基质，即松针粉和细腐殖土，生根效果也较好。其中细腐殖土生根率较高，而且苗长根以后，苗生长明显较快，主要是因为腐殖土养分较足，有利于促进苗的生长，因此，腐殖土是一种很好的白果越橘扦插基质。松针也是粉碎后才能作为扦插基质，本试验中以其为扦插基质，苗的生根率较低，苗长根以后生长也较缓慢，但松针的成本较低。以草炭土作为生根基质，苗长根以后生长也较快，但根部土团容易散开，不方便运输，只宜就近上钵管理。而以苔藓、松针粉、细腐殖土为基质，根长好以后，根在这3种基质中很好地缠绕形成不易散开的团块，方便长途运输。因此，各地应根据自身实际，来选择白果越橘试管外生根扦插基质。

试验表明，白果越橘成熟果实中的新鲜种子和嫩茎段是白果越橘组织培养适宜的外植体。激素对于植物组织和器官的形成具有重要作用，植物的每个生理生化过程都直接或间接地受到生长调节物质的调控。[11]本试验表明，几种激素中，玉米素对白果越橘种子实生苗及嫩茎段腋芽萌发、生长以及增殖效果最好。WPM+1.0 mg/L ZT最有利于白果越橘种子实生苗及嫩茎段腋芽萌发及生长。WPM+0.5 mg/L ZT有利于白果越橘的大量增殖。培养基pH值对其增殖有很大影响，pH值为5.4最有利于白果越橘的增殖，试管苗增殖系数最高。细腐殖土是一种较理想的扦插基质，可以替代苔藓和草炭土作为白果越橘试管苗的扦插基质。

另外，白果越橘种子萌发后，在茎的基部有椭圆形淡绿色的组织形成，这种椭圆形组织在苗的发育过程中随着实生苗的长大而逐渐变大。该椭圆形组织可能是白果越橘的根瘤，需要进一步进行成分分析及鉴定。如果确实是根瘤的话，根瘤的形成是菌根真菌侵染的结果，那就说明白果越橘实生苗中有菌根真菌的存在，这将是一项具有重要意义的研究。现已确认侵染越橘的菌根真菌类型为内生菌根真菌,这一类菌根真菌专性寄生杜鹃花科植物,因而统称为杜鹃花菌根真菌(Ericoidmycorrhiza)[12-16]。在自然条件下，越橘都与菌根真菌共生。本研究主要是对白果越橘进行了组织培养技术研究，白果越橘的根瘤以及菌根真菌以及其他开发利用还有待于今后更加深入的研究。

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