黄皮果果核挥发油对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞增殖和凋亡的影响

廖雪华，甘育鸿，梅思，符伟玉，吴科锋，4，*，李文德

（1.广东医科大学广东天然药物研究与开发实验室，广东湛江524023；2.梅州市人民医院，广东梅州514000；3.广东医科大学生物化学与分子生物学研究所，广东湛江524023；4.广东医科大学南海海洋医药研究院，广东湛江524023；5.广东省实验动物监测所，广东广州510000）

黑色素瘤又称恶性黑色素瘤，是由分布于神经嵴黑色素细胞所形成的痣或色素斑恶化而成，其恶性程度高，具有高度侵袭性，易发生转移，是目前为止导致死亡人数最多的皮肤肿瘤[1-2]。黑色素瘤主要发生在皮肤，但也可发生于眼睛、肠道及体内含有黑色素细胞的任何部分[3-4]。早期黑色素瘤可以通过手术切除达到有效治疗，但中晚期恶性黑色素瘤对常规的放疗、化疗不敏感，缺乏有效的治疗手段[5-6]，且常规的化疗药物存在不良反应大，患者依从性差等特点[7]。因此，从天然的中药材中寻找有效的抗黑色素瘤药物成为研究的热点。

黄皮果为芸香科植物黄皮 [Clausena lansium（Lour.）Skeels]的成熟果实，是药食同源的民间药材，其肉、皮和核皆可入药[8]。黄皮果核具有行气止痛、健胃消肿等多方面的生物活性，常用于治疗胃痛、疝痛、痛经和风湿骨痛[9]。大量文献报道，黄皮果挥发油主要成分为萜类、醇类、酯类、酮类及醛类，进一步的研究也指出，该挥发油具有杀虫、抑菌、抗氧化等作用[10-11]。前期研究发现黄皮果核挥发油主要成分为烯醇类，占挥发油成分的56.74%以上，并可改善因紫外线引起的皮肤老化损伤[12]，而对于其抗肿瘤活性及其他生物活性的研究鲜见报道。因此希望进一步探究该挥发油抗黑色素瘤细胞增殖作用的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株

小鼠黑色素瘤B16-F10细胞：中国科学院细胞库。

1.2 试剂与仪器

黄皮果核挥发油（essential oil of kernel，EOK）：广东医科大学天然药物研究与开发重点实验室保存[12]；磷脂酰丝氨酸蛋白抗体/碘化丙啶（Annexin V-FITC/propidiun iodide，Annexin V-FITC/PI） 细胞凋亡检测试剂盒：北京庄盟国际生物基因科技有限公司；0.25%胰酶溶液（1x）：吉诺生物医药技术有限公司；超敏ECL（electro-chemi-luminescence）化学发光试剂盒（BeyoECL Plus）、罗丹明 123（rhodamine 123，Rh 123）、放射免疫沉淀（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒：碧云天生物技术研究所；胎牛血清、高糖培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、磷酸盐缓冲液（phosphote buffered soline，PBS）：美国 Gibco公司；青霉素-链霉素双抗溶液：广州威佳科技有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]：Sigma 公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美国 SANTA CRUZ公司；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 凝胶快速配置试剂盒：北京鼎国昌盛生物技术有限公司；预染蛋白标记：美国 Thermo公司；β-肌动蛋白（β-actin）、辣根过氧化物酶标记的二抗、P65、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3等一抗：美国SAB公司；一抗稀释液、二抗稀释液：Biosharp公司；0.22 μm聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）：美国 Millipore公司。

IX73型倒置荧光显微镜：Olympus公司；通用水套CO2培养箱：美国Thermo公司；SW-CJ-1D单人单面垂直净化工作台：江苏苏净集团有限公司；HR/T16MM微量高速冷冻离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；SHA-B数显恒温水浴震荡器：天津赛得利斯实验分析仪器制造厂；AUW120D型电子分析天平：日本SHI－MADAU公司；迷你双垂直电泳槽、转印系统：美国Bio-Rad公司；Epoch 酶标仪：美国 Bio-Tek；EPICS XL-MCL流式细胞仪：美国BECKMAN COULTER公司。

1.3 方法

1.3.1 黄皮果果核挥发油（essential oil of kernel，EOK）的提取与分离

称取一定量黄皮果核，加水浸泡后采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，冷却后收集挥发油。采用冷冻结晶法分离得到液态挥发油。通过气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 分析显示，在EOK中检测到33种化合物，其主要化合物是烯醇类，主要成分含量占56.74%。

1.3.2 细胞培养

B16-F10细胞均培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置37℃、5%CO2的培养箱中培养。待细胞长至80%左右时，按1∶3或1∶2传代，取对数生长期细胞进行试验。

1.3.3 MTT法检测细胞存活率

取对数生长期的细胞以3.5×103个/孔均匀接种于96孔板，置37℃、5%CO2培养箱，待细胞贴壁后，加入不同浓度的 EOK（0.2、0.4、0.6、0.8 μL/mL），空白组加入等量生理盐水，每组6个复孔，分别孵育24、48、72 h 后吸取上清液，每孔加入 MTT（5 g/L）20 μL，继续培养4 h，随后小心吸出培养液，加入DMSO 150 μL/孔溶解甲鐕，振荡摇匀，结晶完全溶解后，酶标仪于波长570 nm处测量各孔的吸光度（OD值），并计算细胞抑制率。

1.3.4 观察细胞形态

取对数生长期的细胞以2×104个/孔均匀接种于12孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞贴壁，将培养基更换为不同浓度的含EOK培养基，在37℃孵育24 h后，将培养液更换为适量的PBS，在显微镜下观察并拍照。

1.3.5 细胞凋亡检测

取对数生长期的细胞以5×104个/孔均匀接种于6孔板，置37℃、5%CO2培养箱培养至细胞贴壁。将培养基更换为不同浓度的含EOK培养基，37℃孵育24 h后，用胰酶消化收集细胞于1.5 mL试管中，在4℃、2 000 r/min条件下离心5 min，弃去上清液，用PBS洗涤2遍。细胞悬浮于500 μL的缓冲液中，添加5 μL磷脂酰丝氨酸蛋白抗体并混匀，再加入碘化丙啶试剂10 μL，室温避光反应15 min，然后在1 h内进行流式细胞仪检测。

1.3.6 线粒体膜电位的检测

取对数生长期的细胞以5×104个/孔均匀接种6孔板，置37℃、5%CO2培养箱培养至细胞贴壁。将培养基更换为不同浓度的EOK培养基，37℃孵育24 h后，用无血清培养基洗涤1次，加入稀释好的Rh123工作液（20 μmol/L）1 mL，置细胞培养箱内继续孵育20 min，PBS洗涤3次，倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.7 蛋白免疫印迹试验

RIPA裂解液按试剂盒说明书要求裂解细胞，分离上清液，即细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜。将印迹的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）依次进行封闭、加入对应的一抗、二抗、抗体结合区带加入电化学发光显色液，扫描后保存。以β-actin为内参，分析各组细胞目的蛋白相对表达量。

1.3.8 统计学方法

2 结果与分析

2.1 黄皮果果核挥发油对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞增殖抑制的影响

通过MTT法检测EOK对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10细胞的抗增殖活性，结果如图1所示。

图1 EOK对B16-F10细胞增殖的影响Fig.1 Effect of EOK on the growth of B16-F10 cells

当挥发油浓度为0.2 μL/mL，作用24 h后，对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的抑制率为（5.67±3.25）%，但差异无统计学意义；当作用48、72 h后，抑制率分别为（44.65±3.96）%、（53.39±4.70）%（P＜0.01）。当药物浓度分别为0.4、0.6、0.8 μL/mL时，随着作用时间的增加，细胞增殖抑制率明显升高，且呈现浓度依赖性和时间依赖性。由此可见，EOK对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞具有明显的增殖抑制作用。

2.2 黄皮果果核挥发油对细胞形态影响

EOK处理24 h对B16-F10细胞形态变化的影响结果见图2。

图2显示，对照组细胞贴壁状态良好，紧密排列，呈不规则梭形（图2A）；与对照组相比，EOK作用24 h后，0.2 μL/mL、0.4 μL/mL 组细胞变长，细胞间隙增大，呈现树突网状结构，且有黑色颗粒物；随着药物浓度的增加，细胞数量逐渐减少，细胞形态也骤变，0.8 μL/mL细胞体积明显缩小，呈现固缩的圆形结构，黑色颗粒物不明显，漂浮在细胞培养液中的细胞增多。从形态方面预示着B16-F10细胞处于凋亡状态。

图2 EOK处理24 h对B16-F10细胞形态变化的影响Fig.2 EOK deal with the effect of 24 h on the morphological changes of B16-F10 cells

图3 Annexin V-FITC/PI双染的流式细胞术检测细胞凋亡率Fig.3 Apoptosis rate of B16-F10 cells detected by flow cytometric analysis

2.3 黄皮果果核挥发油对B16-F10细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC染色观察B16-F10细胞凋亡情况见图3。

细胞凋亡的检测方法有很多中，各有其特点。流式细胞术检测细胞凋亡，具有快速、灵敏度高、可以定量等优点。其中Annexin V-FITC/PI双标记染色最为常用。磷脂酰丝氨酸（phasphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，由于细胞膜失去对称性，PS可从细胞膜的内侧翻转至细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖的磷脂结合蛋白，它与PS高亲和力特异性结合。荧光素FITC标记的Annexin V可作为探针检测暴露在细胞膜外侧的的PS，指示凋亡细胞，但坏死细胞PS也会显露在外表使Annexin V-FITC结合成阴性，必须加入碘化丙啶（propidiun iodide，PI）才能区分坏死细胞[13-14]。碘化丙啶是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能通过细胞膜而使细胞核着色。流式细胞仪分析结果显示，与对照组（图3A）比较，随着EOK浓度的增加，凋亡比例也随着增加，其诱导B16-F10细胞凋亡率分别为5.66%、30.34%、36.04%。这表明EOK能诱导B16-F10细胞凋亡。

2.4 黄皮果果核挥发油对B16-F10细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）的影响

罗丹明123（rhodamine 123）是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线粒体跨膜电位的指示剂。其在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度减弱或消失。而在凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位（ΔΨm）的崩溃，Rh123重新释放出线粒体，从而发出强黄绿色荧光，因此可以根据相对荧光信号的强度来衡量MMP的变化[15]。荧光染色法检测B16-F10细胞线粒体膜电位水平见图4。

图4 荧光染色法检测B16-F10细胞线粒体膜电位水平Fig.4 Detection of mitochondrial membrane potential level of B16-F10 cells by fluorescent staining

从图4中可以看出，EOK处理24 h后，与对照组比较，药物处理组细胞内的荧光明显增强，而且随着浓度增大而增强，高浓度组所发荧光非常显著，说明线粒体膜完整性可能已破坏，引起ΔΨm的崩溃，并随药物浓度的不同而使MMP出现不同程度的受损。结果表明EOK诱导细胞凋亡与抑制线粒体膜电位密切相关。

2.5 黄皮果果核挥发油对B16-F10细胞凋亡相关蛋白的影响

NF-κB是一类具有多向转录调节作用的核蛋白因子，在细胞胞浆内是以无活性形式存在，通过I-B激酶（IK）激活后，受抑制的NF-κB得以释放，发生核移位，在核内积累并与特异性的B序列相结合启动转录。核转录因子NF-κB的下调，可促使与抗凋亡相关的NF-κB靶基因如TNF受体相关因子1等表达减弱，从而促进凋亡。NF-κB也可调控Bcl-2家族中两个抗凋亡蛋白：Bfl-1/A1、Bcl-X1的表达，也诱导Bcl-2和抑制Bax基因表达[16-17]。而Bcl-2与Bax这两种蛋白参与构成线粒体通路，分别具有抑制和促进细胞凋亡的作用，Bax/Bcl-2蛋白比值决定了细胞的生存和死亡。凋亡通路相关蛋白Bcl-2/Bax/caspase 3被激活，Bax/Cleaved-caspase 3蛋白表达增加，而Bcl-2蛋白被抑制，是经典的线粒体凋亡途径[18]。

EOK 对 B16-F10 细胞 NF-κB（P-P65）、NF-κB（P65）蛋白表达的影响结果见图5。

图5 EOK 对 B16-F10 细胞 NF-κB（P-P65）、NF-κB（P65）蛋白表达的影响Fig.5 Effect of EOK on NF-κB（P-P65）and NF-κB（P65）protein expression in B16-F10 cells

从图5中可以看出，与对照组相比，随着黄皮果果核挥发油浓度的增加，NF-κB（P-P65）与 NF-κB（P65）蛋白表达均下调，其中在浓度0.2 μL/mL作用下蛋白表达量有所减少（P＜0.01）；且对 NF-κB（P65）蛋白表达的抑制作用比对NF-κB（P-P65）蛋白表达的抑制作用更为明显。同时检测Bcl-2和Bax蛋白的表达情况，结果如图6所示。

图6 EOK对B16-F10细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Fig.6 Effect of EOK on Bax and Bcl-2 protein expression in B16-F10 cells

与对照组相比，随着果核挥发油浓度的增大，Bax蛋白表达增多，其中0.4、0.8 μL/mL组尤为明显（P＜0.05或 P＜0.01）；而 Bcl-2 蛋白表达在 0.8 μL/mL 组减少尤为明显（P＜0.01）。通过统计，Bax/Bcl-2的比值增大，0.4、0.8 μL/mL组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

对B16-F1细胞Cleaved-caspase 3蛋白表达的影响结果见图7。

图7 EOK对B16-F10细胞Cleaved-caspase 3蛋白表达的影响Fig.7 Effect of EOK on Cleaved-caspase 3 protein expression in B16-F10 cells

如图7所示，黄皮果果核挥发油也能上调Cleaved-caspase 3蛋白的表达。与对照组相比，0.4、0.8 μL/mL 组差异有统计学意义（P＜0.01）。这些结果表明，线粒体途径参与黄皮果果核挥发油诱导B16-F10细胞的凋亡，其机制可能与抑制胞内NF-кB P65蛋白表达，降低其磷酸化水平，激活Bcl-2/Bax/caspase 3信号通路有关。

3 结论

水蒸气蒸馏法提取的黄皮果核挥发油作用于小鼠黑色素瘤B16-F10细胞后，MTT法测定药物浓度≥0.2 μL/mL时，黄皮果核挥发油对B16-F10细胞增殖有明显的抑制作用。Annexin V-FITC/PI染色结果表明，在黄皮果核挥发油作用24 h后，0.8 μL/mL组凋亡细胞的比例高达36.06%。在罗丹明123染色检测黄皮果核挥发油对B16-F10细胞线粒体膜电位有显著影响，且随着药物浓度增大，荧光强度增强。蛋白免疫印迹结果表明，黄皮果核挥发油能下调NF-κB（PP65）、NF-κB（P65）、Bcl-2 的表达，同时上调 Bax、Cleaved-caspase 3的表达。因此，试验结果表明：黄皮果果核挥发油以诱导细胞凋亡的方式抑制小鼠黑色素瘤B16-F10细胞增殖，其机制与抑制胞内NF-кB P65蛋白表达，降低其磷酸化水平，激活Bcl-2/Bax/caspase 3信号通路有关。