乳酸菌及其组合发酵芦笋的条件优化

许志美，马雁，印伯星，鲁茂林，桑建，黄玉军，关成冉，顾瑞霞，*

（1.扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏扬州225127；2.江苏省乳业生物工程技术研究中心，江苏扬州225127）

芦笋属于百合科天门冬属多年生草本植物，含有多种营养元素、人体必须氨基酸和矿物质，同时富含黄酮类等多种生物活性成分，具有抗肿瘤、抗突变、抗衰老、降血脂、免疫调节等生物功能[1]，在当今社会越来越受到人们的关注和喜爱。但芦笋作为一种季节性蔬菜，种植范围非常受季节和地域的限制，不易在冬季和部分地区被人购买食用，并且，芦笋储存时间一旦过长，不仅营养物质大量流失，还会产生亚硝酸盐等有毒有害物质。

近年来，关于芦笋深加工研究的报道众多，如芦笋茶、芦笋酸奶、芦笋饮料和芦笋酒等方便食品[2-5]，利用芦笋提取物开发的芦笋口服液、芦笋冲剂、芦笋胶囊等保健品陆续上市[6]，然而，关于芦笋发酵蔬菜类产品的报道却很少。乳酸菌是一群能发酵碳水化合物并产生大量乳酸的益生菌，乳酸菌发酵蔬菜是降低亚硝酸盐、提高安全性以及增加营养成分的一种有效方法[7]。

本文采用不同乳酸菌及其组合发酵绿芦笋，以自然发酵为对照，通过比较芦笋发酵过程中各成分的动态变化，选择适用芦笋发酵的最佳乳酸菌及最佳发酵时间，为发酵芦笋产品制作提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿芦笋：市售；发酵乳杆菌Xd（Lactobacillus fermentum Xd）、植物乳杆菌5-7-3（Lactobacillus plantarum 5-7-3）：从传统酸菜中分离获得，由江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室菌种库保藏；德氏乳杆菌保加利亚亚种Y430（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus Y430）、副干酪乳杆菌 Yd（Lactobacillus paracasei Yd）：从乳制品中分离获得，由江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室菌种库保藏；乙醇、草酸、2，6-二氯靛酚、亚铁氰化钾、冰醋酸、乙酸锌、四水硼酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸、盐酸乙二胺、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；抗坏血酸标品、芦丁标品：纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司；MRS液体培养基：青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

JF-SX-500全自动灭菌锅：日本TOMY公司；ZHJH-C1209B超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；FIS#13-636 XL25型 pH 计：Fisher Scientific；Millipore Direct8超纯水仪：美国Millipore公司；SPX-150BS-1I生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；Bio-Tck ELX800酶标仪：美国宝特公司；5804R型高速冷冻离心机：美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

在无菌条件下，将冻干保存的4株乳酸菌Xd、5-7-3、Y430、Yd按5%的接种量接种到MRS液体培养基中，混匀后置于37℃培养箱培养24 h，作为1代菌，同样操作重复两次，活化至3代菌，待用。

1.3.2 芦笋发酵工艺流程

参考莲藕发酵方法并适当调整[8]。

新鲜绿芦笋→切除根部→清洗→切段（5 cm～6 cm长）→95℃热水中漂烫处理3 min→沥干→添加配料（20 g/kg盐和40 g/kg糖）→接菌（5 g/100 g乳酸菌菌液）→密封置于30℃暗处发酵→于芦笋发酵的第0、2、4、6、8、10、12 天各取 100 g芦笋样品，以用于营养功能指标检测。

1.4 检测指标

1.4.1 pH值的测定

芦笋样品与去离子水1∶1（g/mL）混合制成芦笋匀浆，称取10.00 g芦笋匀浆离心，用pH计直接测定上清液pH值，即为芦笋样品pH值。

1.4.2 总酸的测定

采用直接滴定法[9]，称取10.00g芦笋匀浆，加80 mL去离子水，沸水浴加热30 min，使有机酸全部溶出，冷却后加水定容至250 mL，4 500 r/min离心10 min，得上清液。称取25 g上清液，加40 mL去离子水，滴加2滴酚酞溶液（0.2 mol/L），用 NaOH 溶液（0.01 mol/L）滴定至溶液变成粉红色且30 s不褪色，记录消耗的NaOH溶液体积，计算出总酸含量。同时用去离子水代替样品做空白试验。

1.4.3 抗坏血酸的测定

采用2，6-二氯靛酚滴定法[10]。称取10.00 g芦笋匀浆，用草酸溶液（20 g/L）定容至 100 mL，4 500 r/min离心10 min，得上清液。吸取10 mL上清液，用标定过的2，6-二氯靛酚溶液（0.2 mg/mL）滴定至变成粉红色且30 s不褪色，记录消耗的2，6-二氯靛酚溶液体积，计算出抗坏血酸含量。同时用去离子水代替样品做空白试验。

1.4.4 黄酮的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法[11]，略作修改。芦丁标准曲线绘制：分别吸取 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL芦丁标准溶液（0.1 mg/mL），用去离子水补至1 mL，加1 mL 的 NaNO2溶液（0.05 g/mL），混匀后静置 6 min，加1 mL的Al（NO3）3溶液（0.1 g/mL），混匀后静置6 min，加3 mL的NaOH溶液（0.04 g/mL），混匀后静置15 min，于波长510 nm处测定OD值。以芦丁含量（mg）为x，510nm处的OD值为y，绘制芦丁标准曲线。样品测定：称取5.00 g芦笋匀浆，加50 mL 70%乙醇溶液，50℃超声波辅助提取30 min，4 500 r/min离心10 min，得上清液。取1 mL上清液，按照芦丁标准曲线测定方法进行操作，根据芦丁标准曲线计算出黄酮含量。同时用去离子水代替样品做空白试验。

1.4.5 亚硝酸盐的测定

采用盐酸萘乙二胺法[12]。亚硝酸钠标准曲线绘制：吸取 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL亚硝酸钠标准使用液（5.0 μg/mL），加2 mL对氨基苯磺酸溶液（4 g/L），混匀，静置5 min，加1 mL盐酸萘乙二胺溶液（2 g/L），定容至 50 mL，混匀，静置 15 min，于波长538 nm处测OD值，以芦丁含量（mg）为x，538 nm处的OD值为y，绘制亚硝酸钠标准曲线。样品测定：称取5.00 g芦笋匀浆，加12.5 mL饱和硼砂溶液（50 g/L），搅拌均匀，加300 mL去离子水，沸水浴加热15 min，冷却，加5 mL亚铁氰化钾溶液（106 g/L），匀，加5 mL乙酸锌溶液（220g/L），定容至500 mL，摇匀后放置30 min，4 500 r/min离心10 min，得上清液。吸取40.0 mL上清液，按照亚硝酸钠标准曲线测定方法测定，根据亚硝酸盐标准曲线，计算出亚硝酸盐含量。同时用去离子水代替样品做空白试验。

1.5 数据处理与统计分析

所有试验均重复3次，采用Microsoft Excel 2016整理试验数据，采用IBM SPSS Statistics 22统计分析试验数据，采用OriginPro 2017绘图。结果以均值±标准差（Mean±SD）表示，不同处理间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Duncan法，当P＜0.05时，判定为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同乳酸菌及其组合发酵芦笋过程中pH值的变化

pH值是判别发酵程度的重要因素，一般来说，发酵蔬菜成熟时的pH值为3.5左右，此时风味最佳[13]。用4株乳酸菌（发酵乳杆菌Xd、植物乳杆菌5-7-3、德氏乳杆菌保加利亚亚种Y430、副干酪乳杆菌Yd）及其6 种双菌株组合（Yd+Xd、Yd+Y430、Yd+5-7-3、Xd+Y430、Xd+5-7-3、Y430+5-7-3）在 30 ℃条件下发酵芦笋12 d，每2 d测定发酵芦笋的pH值，其pH值变化情况如图1所示。

图1 不同乳酸菌及其组合发酵芦笋过程中pH值的变化Fig.1 Changes of pH value during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

由图1可知，芦笋pH值随着发酵时间的延长出现下降趋势。自然发酵芦笋的pH值缓慢下降，其pH值从6.55下降至4.24。乳酸菌发酵芦笋的pH值快速下降，在发酵前8 d，pH值快速从6.55下降至3.44，此时乳酸菌发酵芦笋已经开始成熟，在发酵8 d～12 d，pH值趋于稳定，其范围为3.19～3.44。不同乳酸菌及其组合发酵芦笋之间的pH值无显著性差异（P＞0.05）。

2.2 不同乳酸菌及其组合发酵芦笋过程中总酸的变化

总酸是判别发酵程度的另一个重要因素，发酵蔬菜的最适总酸范围为6 g/kg～8 g/kg，此时口感最佳[13]。用4株乳酸菌及其6种双菌株组合在30℃条件下发酵芦笋12 d的总酸含量变化情况如图2所示。

图2 不同乳酸菌及其组合发酵芦笋过程中总酸的变化Fig.2 Changes of total acid during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

由图2可知，发酵芦笋的总酸含量在发酵前期快速上升，而在发酵后期，其总酸含量趋于稳定。自然发酵芦笋的总酸含量上升最缓慢，在发酵12 d期间，从0.84 g/kg增加到4.54 g/kg，酸度不足，发酵芦笋不能达到最佳口感。除了Yd发酵芦笋外，乳酸菌发酵芦笋的总酸在发酵8 d～12 d期间趋于稳定，其总酸含量处于6 g/kg～8 g/kg，此时发酵芦笋口感最佳。乳酸菌发酵芦笋在发酵8 d时均已经开始成熟。而Yd发酵芦笋的总酸含量在发酵后期仍快速增加，在发酵10 d时为8.48 g/kg（＞8 g/kg），口感已经不是最佳。

2.3 不同乳酸菌及其组合发酵芦笋过程中抗坏血酸的变化

抗坏血酸是芦笋中含量较高的维生素，是一种高效抗氧化剂，其含量影响芦笋的抗氧化能力。用4株乳酸菌及其6种双菌株组合在30℃条件下发酵芦笋12 d的抗坏血酸含量变化情况如图3所示。

图3 不同乳酸菌及其组合发酵芦笋过程中抗坏血酸的变化Fig.3 Changes of ascorbic acid during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

由图3可知，在整个发酵期间，发酵芦笋中的抗坏血酸含量均呈现下降趋势。其可能是原料中的抗坏血酸渗透到发酵液中而流失或被氧化而减少[14]，这与白菜发酵过程的抗坏血酸含量研究[15]和辣椒腌制过程的抗坏血酸含量研究的结果一致[16]。自然发酵的抗坏血酸含量下降最快，从18.17 mg/100 g下降至6.03 mg/100 g。乳酸菌发酵芦笋的抗坏血酸含量始终高于自然发酵。Y430发酵芦笋的抗坏血酸含量最高，在发酵12 d时仍保留11.35 mg/100 g，Yd+Y430发酵芦笋的抗坏血酸含量仅低于Y430发酵组，在所有乳酸菌组合发酵芦笋中最高，在发酵12 d时，其抗坏血酸含量为10.28 mg/100 g。

2.4 不同乳酸菌及其组合发酵芦笋过程中黄酮的变化

黄酮是一种功能性很强的抗氧化剂，其含量同样影响芦笋的抗氧化能力。用4株乳酸菌及其6种双菌株组合在30℃条件下发酵芦笋12 d的黄酮含量变化情况如图4所示。

由图4可知，自然发酵芦笋的黄酮含量在发酵前8 d一直低于乳酸菌发酵组，其在发酵0～2 d下降至7.499 mg/100 g，在发酵 2 d～8 d 上升至 3.668 mg/100 g，在发酵8 d～12 d保持稳定。乳酸菌发酵芦笋的黄酮含量在整个发酵期间均呈现先上升后下降趋势，其在发酵8 d时达到最大值，Y430和Yd+Y430发酵芦笋的黄酮含量明显高于其他发酵组，分别为63.174 mg/100 g和56.622 mg/100 g。在发酵前期，可能是乳酸菌发酵能够产生多种酶，促进黄酮合成[17]。在发酵后期，可能是发酵产酸导致强酸环境，黄酮在强酸环境中不稳定而被分解[18]。

图4 不同乳酸菌及其组合发酵芦笋过程中黄酮的变化Fig.4 Changes of flavonoids during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

2.5 不同乳酸菌及其组合发酵芦笋过程中亚硝酸盐的变化

亚硝酸盐是一种强毒性物质，可与仲胺反应生成致癌物亚硝胺[8]。在食品安全国家标准中，蔬菜及其制品和腌渍蔬菜的亚硝酸盐限量为20 mg/kg[19]。用4株乳酸菌及其6种双菌株组合在30℃条件下发酵芦笋12 d的亚硝酸盐含量变化情况如图5所示。

图5 不同乳酸菌及其组合发酵芦笋过程中亚硝酸盐的变化Fig.5 Changes of nitrite during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

由图5可知，最初芦笋原料的亚硝酸盐含量很低，只有1.34 mg/kg，在整个发酵期间，发酵芦笋的亚硝酸盐含量呈先上升后下降趋势，出现亚硝峰，这可能是植物中存在的硝酸还原酶所致[20-21]。自然发酵芦笋在发酵6 d时出现亚硝峰，其峰值为46.32 mg/kg，发酵6 d后，其亚硝酸盐含量一直维持较高水平，在发酵12 d时为39.33 mg/kg。乳酸菌发酵芦笋的亚硝酸盐含量在整个发酵期间明显低于自然发酵，在发酵8 d时，乳酸菌发酵芦笋的亚硝酸盐均低于20 mg/kg，达到食用安全期。Yd+Y430和Xd+Y430发酵芦笋的亚硝峰提前出现在发酵4 d时，其亚硝酸盐峰值分别为21.80 mg/kg和20.20 mg/kg，其食用安全期也提前至发酵6 d，此时其亚硝酸盐含量分别为16.36 mg/kg和17.27 mg/kg（＜20 mg/kg）；Y430和Y430+5-7-3发酵芦笋的亚硝酸盐峰值分别为19.33 mg/kg和10.61 mg/kg（＜20 mg/kg），一直处于在食品安全国家标准的亚硝酸盐限量内，所以Y430和Y430+5-7-3发酵芦笋无亚硝酸盐危害。

3 讨论

乳酸菌发酵蔬菜有利于改善风味，抑制杂菌生长，提高产品安全性[13]。本文采用4株乳酸菌及其6种双菌组合发酵绿芦笋，从产酸能力来看，4株乳酸菌和6种双菌组合均具有迅速发酵能力，使pH值快速降低而总酸含量快速升高，使产品快速达到风味最佳时要求的外部条件，同时，后期的酸性环境也可抑制杂菌的生长。乳酸菌发酵芦笋的pH值和总酸含量在发酵8 d～12 d期间趋于稳定，这可能是乳酸菌在前期快速生长产生大量乳酸而在后期受到强酸环境抑制而减少甚至停止产酸[6，23]。

从营养与功能成分来看，4株乳酸菌和6种双菌组合均具有改善营养与功能成分能力，乳酸菌发酵芦笋中抗坏血酸和黄酮含量均高于自然发酵芦笋，有利于增强发酵芦笋的抗氧化性。Y430和Yd+Y430发酵芦笋的抗坏血酸含量和黄酮峰值含量明显高于其他乳酸菌及其双菌组合发酵。这表明Y430和Yd+Y430对抗坏血酸的抑制作用和对黄酮合成的促进作用最强。

从安全性来看，4株乳酸菌和6种双菌组合均具有降解亚硝酸盐能力，乳酸菌发酵芦笋的亚硝酸盐含量明显低于自然发酵，有利于提高发酵芦笋的安全性。乳酸菌降解亚硝酸盐机理主要是酶降解和酸降解两种[24]。乳酸菌生长代谢能够产生亚硝酸盐还原酶，促使亚硝酸盐进行酶降解[25]。乳酸菌快速产酸，促使亚硝酸盐进行酸降解[26]。另外，与其他菌株发酵相比，Y430和Yd+Y430发酵芦笋中亚硝酸盐含量也较低，这可能是因其抗坏血酸和高酮含量较高，具有还原性的抗坏血酸和黄酮也能够降解亚硝酸盐[27-28]。

4 结论

本文采用4株乳酸菌及其6种双菌组合发酵绿芦笋，结果显示：乳酸菌发酵芦笋的产酸能力、降解亚硝酸盐能力、抗坏血酸和黄酮含量均高于自然发酵，其中Y430和Yd+Y430分别是芦笋发酵的最佳单菌和最佳双菌组合，芦笋发酵的最佳时间为8 d。为人工接种发酵芦笋运用到工业化生产中提供一定的理论依据。