葡萄根癌病病原菌的筛选及鉴定

尹向田，魏彦锋，徐 亮，杨 阳

（1山东省葡萄研究院/山东省葡萄栽培与精深加工工程技术研究中心，济南250100；2北京市大兴区林业工作站，北京102600）

0 引言

葡萄根癌病是世界上普遍发生的一种细菌病害，在国内主要葡萄栽培地区均有分布。得病后植株生长衰弱，产量下降，严重者全株枯死，已成为对葡萄优质高效、安全生产潜在危险较大的病害[1]。葡萄根癌病菌属于土壤杆菌属，它可从伤口侵染多种植物的根茎部，使植物细胞转变成自发性增生的肿瘤细胞，引起瘿瘤症状[2-3]。土壤杆菌属内菌株生物多样性显著，同种寄主植物上病原菌可能不同，并且不同化学杀菌剂及生防制剂对不同类型的土壤杆菌表现出不同的抑制效果[4-5]。

根癌土壤杆菌有3个变种，即Agrobacterium tumefaciens、Agrobacterium rhizogenes和Agrobacterium vitis[6-7]。Panagopoulos等首次发现为害葡萄菌株不同于其他根癌土壤杆菌，1900年Ophel和Kerr将侵染葡萄的根癌农杆菌定义为一个新种A.vitis[8-9]。葡萄根癌病主要由葡萄土壤杆菌引发，少数由根癌土壤杆菌引起[10-11]。国内，1985年游积峰等[12]首次对葡萄根癌病病原菌类型进行鉴定，之后并未有对山东地区酿酒葡萄根癌病病原菌的报道。根癌土壤杆菌的致病性与细菌细胞内的Ti质粒有关。当病原菌侵染寄主时，Ti质粒的一部分(T-DNA)转入并整合到寄主基因组中，借助植物的转录和翻译系统进行表达[13]。T-DNA编码的基因在寄主植物肿瘤表达时可产生一类称为冠瘿碱的氨基酸衍生物。为病原菌提供营养和能量[14-15]。根据细菌侵染植株形成肿瘤产生的冠瘿碱类型，可将Ti质粒分为章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和农杆菌素碱型4种类型[16]。葡萄土壤杆菌的Ti质粒以章鱼碱为主。

‘赤霞珠’葡萄为济南南部山区主要酿酒葡萄品种之一，近几年根癌病发生极为严重，个别地块发病率能达到60%，造成极大的经济损失。近几年对葡萄根癌病的研究也相对较少。本研究从济南南部山区采集新鲜发病的葡萄瘿瘤用稀释平板法分离得到根癌土壤杆菌类似菌株，采用形态学、生理生化特征及16S rDNA对病原菌进行鉴定，利用接种实验确定发病较强的菌株，并通过质粒中编码冠瘿碱相关基因的检测明确该病原菌类型，从而为采取有效措施防治葡萄根癌病打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 葡萄根癌病组织 葡萄根癌病组织材料于2016年8月采自济南市南部山区，寄主为5年生‘赤霞珠’葡萄。

1.1.2 供试菌株 葡萄根癌土壤杆菌(Agrobacterium vitis)IAM14140购买自中国微生物菌种保藏管理中心。实验于2016年8月—2017年12月在山东省葡萄研究院良种与栽培研究室进行。

1.1.3 致病性检测植物

（1）向日葵幼苗。向日葵种子28℃培养箱中保湿催芽，萌发后播种于100 mm×100 mm穴盘中，每盆5颗，2片子叶伸出土面5 cm左右时接种。

（2）胡萝卜组织块。将新鲜胡萝卜用酒精消毒后切成厚度约1 cm的圆片，置于铺有滤纸的培养皿中，滤纸加入无菌水保湿。

（3）葡萄幼苗。选取一年生盆栽葡萄幼苗，待叶片长出5片时接种。

1.1.4 培养基

（1）MW培养基（用于土壤杆菌的分离）。甘露醇10.0 g，K2HPO40.3 g，NaNO35.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，NaCl 2.0 g，生物素100 µg，0.1%Fe-EDTA 2 mL，0.1%结晶紫2.0 mL，琼脂粉20.0 g，加蒸馏水至1 L，pH 7.0～7.2。

（2）YEB培养基（用于活化、保存病原菌）。酵母提取物1 g，牛肉浸膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，加蒸馏水至1 L，琼脂15 g或不加，pH 7.8。

1.2 病原菌的分离

参照马德钦等[5]的方法，取根癌瘤内部新鲜组织用5%的次氯酸钠溶液消毒5 min，并经无菌水漂洗后放入研钵中，加少量无菌水捣碎混匀后，用无菌水分别稀释10、100倍，取稀释好的上清液涂于MW培养基平板上，28℃下培养5～7天，挑取表面光滑、圆形突起菌落，置于YEB培养基平板上纯化，于4℃保存待用。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1 菌株形态学及生理生化鉴定 挑取菌株单菌落于YEB平板上划线并置于28℃培养4天，观察单菌落形态。进行革兰氏染色后在油镜下观察菌体形态；生理生化鉴定参照任欣正等[17]的方法。

1.3.2 葡萄根癌病菌的16S rDNA序列分析 采用天根细菌基因组DNA小量制备试剂盒提取DNA，用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’进行 PCR扩增，PCR产物用天根DNA凝胶回收试剂盒回收后，委托上海派森诺生物科技股份有限公司进行测序，将所得到的16S rDNA序列用NCBI Blast程序与NCBI ribosomal RNA sequence数据库中的数据进行比对，利用MEGA6.0软件绘制系统发育树。

1.4 病原菌的致病性测定

挑取保存的菌株与YEB平板上划线，28℃培养72 h，挑取单菌落于YEB液体培养基中28℃160 r/min培养24 h，制备浓度为1×108cfu/mL的菌悬液。以划伤接种方式用灭菌脱脂棉蘸取菌液接种到向日葵及葡萄幼苗根茎处，用保鲜膜包裹并保湿；胡萝卜圆盘接种采用涂抹法。以无菌水处理为对照，将接种材料置于28℃、光照4000 lx条件下培养，每隔7天观察统计肿瘤生长情况。

1.5 葡萄根癌病菌的质粒类型测定

根据赵小兰等[18]方法设计引物，扩增章鱼碱型质粒的引物为ZYJ1(5’-ATGGCTAAAGTGGCAATTTT GGG-3’)、ZYJ2(5’-TCAGATTGAATTCGCCAACTC G-3’)。扩增胭脂碱型质粒的引物为YZJ1(5’-TGAC AGGATATATTGGCGGGTAA-3’)、YZJ2(5’-TGCTC CGTCGTCAGGCTTTCCGA-3’)。用上述引物进行PCR扩增并测序。利用MEGA6.0软件绘制系统发育树。

2 结果与分析

2.1 葡萄根癌病的田间发病症状

病害在8月时大量发生，降雨多、湿度大时瘿瘤发生多。症状表现为在葡萄的根颈部、老龄树干等器官上出现数个大小不等、形状各异的瘿瘤。初期形成的瘿瘤较小，呈圆形突起，乳白色，较光滑，随着瘤体的长大，颜色变深，后期呈深褐色，瘤体表面粗糙（图1B、C、D）。受害植株生长衰弱，叶片小而黄，严重者全株枯死（图1A）。

2.2 葡萄根癌病病原菌的筛选

用稀释平板法分离葡萄瘿瘤内部新鲜组织中的冠瘿瘤病原菌，结果表明从根瘤内部新鲜组织中分离到40株细菌。其中在MW培养基中分离出12株菌落形态与土壤农杆菌相似的细菌，编号为JC01～JC12。将分离菌在YEB培养基纯化。28℃培养3天后，12株细菌菌落均为灰白色、圆形突起、半透明、边缘整齐、有光泽。革兰氏染色阴性（图2）。

图1 葡萄根癌病田间发病症状

图2 病原菌形态特征

2.3 菌株生理生化鉴定

参考《伯杰细菌鉴定手册》及《植物病原细菌分类和鉴定》检测根癌农杆菌生物型的方法，检测12株菌的生物型。从表1可以看出，根据生理生化指标，12株菌包括3种类型的根癌土壤杆菌。JC02、JC05及JC11与生物Ⅲ型菌株相符合，JC01、JC03、JC06、JC07、JC09与生物Ⅰ型菌株相符合，JC04、JC08、JC10、JC12与生物Ⅱ型菌株相符合。

2.4 菌株16S rDNA鉴定结果

提取12株菌的基因组DNA，扩增其16S rDNA片段，PCR产物测序后得到长度为1403 bp的序列，将序列上传至Genbank比对，发现与Genbank中相似度大于98%的菌株均为土壤杆菌属(Agrobacteriumspp.)。选取相似度大于99%的17个菌株与所分离的12株菌的16S rDNA序列构建系统发育树，由图3可以看出，JC02、JC05、JC11与葡萄土壤杆菌(A.vitis)聚为一支。与登录号为NR036780.1、CP000634.1、D12795.1的菌株同源性最接近。结合形态学及生理生化特征，可确定JC02、JC05、JC11为葡萄土壤杆菌。其他菌株与根癌土壤杆菌(A.temefaciens)聚为一大类，JC01、JC03、JC06、JC07、JC09与JC04、JC08、JC10、JC12分别在不同的分支上。JC01、JC03、JC06、JC07、JC09序列相似度为99.9%，同登录号为HQ735085.1的菌株同源性最近。JC04、JC08、JC10、JC12相似度为100%，同登录号为CP019702.1的菌株同源性最近。JC01同JC04之间的相似度为99.5%，有6个碱基不同。

2.5 菌株致病性测定

将分离出的12株细菌分别接种在新鲜的胡萝卜圆盘、向日葵茎部及葡萄幼苗根茎部。每隔7天观察1次接种部位。结果表明，不同菌株致病性不同，其中，JC02、JC05致病性最强，且均能使3种植物发病。JC02、JC05菌株接种胡萝卜圆盘中心16天后出现明显的绿色增生物质。向日葵幼苗接种JC02、JC05菌株7天后开始出现乳白色的瘤状突起，与对照组相比，14天后，经处理的向日葵幼苗根颈部出现明显的肿瘤凸起，肿瘤表面粗糙，肉质化。葡萄一年生幼苗接种JC02、JC05后30天在伤口部位出现了典型的肿瘤，直径可达2 cm。JC11、JC06、JC07可形成较小的瘿瘤。JC04、JC08均不能使3种植物发病。其余菌株能形成小瘤，但出现时间较长，且不长大（图4）。

2.6 葡萄根癌病菌质粒类型测定

以YZJ1/YZJ2及ZYJ1/ZYJ2为引物对JC02、JC05进行PCR扩增，结果表明，以ZYJ1/ZYJ2为引物JC02、JC05菌株在300 bp左右均扩增出明显条带，未扩增出胭脂碱型质粒产物。将测序结果BLAST发现，共有7个序列与所测序列相似度较高，均大于89%，并且均为章鱼碱型质粒。JC02、JC05同Agrobacterium vitis的相似度均大于90%，与A.vitisTm4及A.vitisCG474相似度为分别为99%、93%。同A.tumefaciens类型菌株相似度较低，均为89%。系统发育树结果表明JC02、JC05同A.vitis（登录号为U83987.1）的序列聚为一类，因此可确定JC02、JC05为章鱼碱型质粒（图5）。

表1 病原菌生理生化检测

图3 基于16S rDNA序列构建的葡萄根癌病病原菌相关种的系统发育树

3 结论

本研究采集济南南部山区‘赤霞珠’葡萄瘿瘤组织进行分离。经形态学、生理生化、16S rDNA检测表明，分离得到的根癌土壤杆菌有3种类型，以生物Ⅰ型为主。致病性检测表明，葡萄土壤杆菌JC02、JC05致病性最强，并且均为章鱼碱类型。

4 讨论

根癌病的发生是由根癌土壤杆菌属细菌引起的，根癌土壤杆菌致病性取决于病原菌的生物型[19-20]。笔者采用MW选择培养基从葡萄幼嫩瘿瘤中分离得到12株根癌土壤杆菌类似菌株，对于病原菌类型的鉴定，运用生理生化特征及16S rDNA鉴定可以初步鉴定出病原菌的生物型[21]。本试验检测了致病菌的生理生化特征，并将菌株的16S rDNA序列进行比对后构建系统发育树。在分离得到的12株菌中，生化Ⅰ型5株、生化Ⅱ型4株、生化Ⅲ型3株，生化Ⅰ型更占优势。以往研究表明，葡萄根癌病病原菌主要以生化Ⅲ型为主，这也许与土壤与环境差异有关。研究表明土壤营养条件能影响根际微生物的生长和数量[22]。寄主植物种类也与微生物种类有密切的关系[23]。

从肿瘤中，往往可分离到致瘤的和不致瘤的土壤杆菌菌系，它们在菌落形态和生理生化特性上没有区别，因此致病性实验是确定种不可缺少的步骤[24-25]。采用伤口接种方法将12株细菌分别接种在胡萝卜圆盘、向日葵幼苗和葡萄幼苗上，以验证菌株致病性及致病范围。结果表明，不同菌株致病性差异较大，本研究也表明，葡萄土壤杆菌JC02和JC05致病性最强，均能使3种指示植物发病，致病范围较广。JC11虽然也属于葡萄土壤杆菌，但是致病性较弱。大量研究均已证实葡萄土壤杆菌对葡萄根癌病致病性较强。并且相同种的不同菌株之间致病性及寄主植物范围有差别[5,12,26]。

对于病原菌类型的鉴定，运用生理生化特征可以初步鉴定出病原菌的生物型[16]。但是对于冠瘿碱类型的鉴定，还需要借助其他手段。传统方法是挤取冠瘿组织的汁液后运用高压纸电泳确定。马德钦等[5,12]运用Ag162Ti质粒的T-DNA区片段为探针对病原菌进行Southern杂交分析。赵小兰等[18]以T-DNA中高度保守的virD2和ipt基因的部分序列设计引物进行PCR检测。但是很少有对编码生物碱基因序列的测定。本研究选取根癌土壤杆菌质粒T-DNA中编码生物碱基因中的部分区段设计引物进行扩增并测序，结果表明同JC02和JC05类似的序列仅有7个，并且均属于章鱼碱类型。本研究仅对葡萄根癌病病原菌类型进行了鉴定，对根癌菌的生物学特性及发病规律还需进一步研究，从而为葡萄根癌病的防治打下基础。

图4 病原菌致病性检测结果

图5 基于根癌土壤杆菌质粒T-DNA部分序列的系统进化树