类风湿关节炎免疫学发病机制研究的最新进展*

周 莹，王子铭，虞 伟，李晓军

(1.江苏大学医学院，江苏镇江 212013；2.东部战区总医院中心实验科，南京 210002)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性炎症反应与进行性骨损伤为特征的自身免疫性疾病。RA患者多表现有免疫系统功能紊乱，也可并发心、肺、肾、神经和血管等多个系统疾病[1]。随着医疗水平的不断发展，RA患者的病情进展可通过正规的治疗得到缓解，但仍不能彻底治愈，因此，探索RA的发病机制对于精准治疗就显得非常重要。RA的发病机制十分复杂，迄今没有一个明确结论。一般认为是某种环境因素(如吸烟、微生物感染)作用于有一定遗传背景的人，刺激引发免疫病理反应所致。本文仅就RA发病有关免疫学机制研究的最新进展作一综述，以期为临床研究及治疗提供理论依据。

1 RA相关遗传因素

人类白细胞抗原(HLA)II类等位基因与RA之间的联系可追溯至组织和HLA分型的早期[2]。但迄今对于RA发病机制，特别是与抗原特异性相关的主要组织相容性复合体(MHC)限制性免疫应答机制，仍缺乏更准确的解释。现有的普遍观点认为，在与RA相关HLA II类等位基因的肽结合槽内，存在共同氨基酸序列(共享表位)，为HLA II类分子参与致病提供了间接依据。更准确地说，HLA-DR β链的70-74位点处5个氨基酸(QKRAA或QRRAA)，形成了HLA II类分子的带正电荷的P4结合槽，该结合槽对于含精氨酸的肽是不利结合位点，而更容易结合瓜氨酸化修饰后的同一种肽，是RA的强易感因子[3]。最近，Ohmura等[4]提出了一种新的自身抗体产生机制：错误折叠的蛋白质与内质网中的HLA II类分子结合，被处理后呈现在细胞表面，这种错误折叠的蛋白质/HLA II类分子复合物可以刺激B细胞，诱导自身抗体产生。令人惊讶的是，RA易感人群HLA II类分子可以有效地结合IgG重链(IgGH)，但与RA相关性差的人，其HLA II类分子则不能结合IgGH。因此，通过错误折叠的自身抗原与某些HLA II类分子的亲和力，可以判定患者对某些自身免疫病(如RA)的易感性。

2 蛋白质修饰

2.1 瓜氨酸化 瓜氨酸化是一种蛋白质翻译后的修饰过程，指蛋白质肽链中的精氨酸残基在肽基精氨酸脱亚氨酶(peptidyl arginine deiminases，PADs)作用下转化为瓜氨酸残基。

瓜氨酸化修饰可改变氨基酸的总电荷和氢键结合力，影响该氨基酸与其他蛋白质在结构上的相互作用，并且在某些情况下改变蛋白质结构域。因此，瓜氨酸化修饰可以通过改变蛋白质一级、二级和三级结构，改变抗原加工、抗原提呈和免疫识别过程，从而增加抗原多态性[3]。能够识别瓜氨酸化蛋白的所有抗体统称为抗瓜氨酸化蛋白抗体(anti-citrullinated proteins antibodies，ACPA)。在过去几年中，针对瓜氨酸化蛋白的自身抗体已经成为RA的主要研究对象，并列为RA的分类标准，作为早期诊断RA并预测疾病进展的血清学标志物。近年来，已经鉴定出了多种瓜氨酸化自身抗原，如纤维蛋白原、波形蛋白、纤连蛋白和α-烯醇酶，并发现相应的自身抗体。

2.2 肽基精氨酸脱亚氨酶(PADs) 肽基精氨酸脱亚氨酶有五种同工酶，分别表达于不同组织。其中，PAD2和PAD4在RA患者血液和滑膜组织中高表达，被认为是驱动RA患者自身抗原瓜氨酸化的主要因素。PAD2主要在肌肉组织、中枢神经系统和造血细胞中表达，而PAD4是一种Ca2+依赖性酶，可能与RA遗传易感性相关，主要分布于造血细胞(尤其是中性粒细胞的祖细胞)[5～7]。除了组织表达差异，PAD2具有细胞质分布特性，而PAD4主要存在于细胞核中[8～9]。这些研究结果提示了不同PAD作用于不同细胞底物的可能性，不同自身抗体可能表明瓜氨酸化特异性PAD的活性。有趣的是，PAD4自身有10个瓜氨酸化潜在位点，可在体外和表达PAD4的细胞中自动被瓜氨酸化，其中372和374位点的精氨酸可能是使酶失活的潜在靶标[9]。但是，PAD4在正常细胞内自动保持瓜氨酸化平衡的机制尚不明确，推测可能与体内Ca2+浓度的变化有关；并且RA患者的PAD4如何耐受自身瓜氨酸化的机制也不十分清楚。此外，PAD3主要分布于皮肤，Seaman等[10]发现抗PAD3抗体水平与关节侵蚀程度相关，且PAD3和PAD4之间交叉反应的抗体可能导致PAD4活性增加。因此，抗PAD3抗体可能是预测RA患者关节损伤的重要标志物。

3 RA相关的免疫应答

在揭示瓜氨酸化自身抗原在RA中的致病性之后，越来越多的研究致力于发现自身免疫反应的特点和规律，以期实现对自身免疫过程进行调控。

3.1 T细胞 目前，对瓜氨酸具有反应性的CD4+T细胞已被证实为部分ACPA的靶标。James等[11]研究发现，健康受试者和RA患者的外周血中均可检测到瓜氨酸特异性CD4+T细胞，但与健康受试者相比，RA患者的瓜氨酸特异性CD4+T细胞具有较高的检出频率，且大多数显示为Th1记忆表型。与此同时，在RA诊断后的前5年内，瓜氨酸特异性CD4+T细胞的检出频率最高，在服用生物制剂的患者中降低。这些发现为瓜氨酸特异性CD4+T细胞与RA的相关性提供了一定的理论依据，但CD4+T细胞活化及促进RA疾病进展的机制仍需进一步探究。正常情况下，T细胞对自身抗原耐受，以避免自身免疫反应的发生，同时又必须对外来抗原具有反应性，以对抗感染。随后，Salmond等[12-13]的一项研究结果提示，PTPN22(编码酪氨酸磷酸酶)通过限制初始T细胞和效应T细胞的T细胞抗原受体(TCR)对自身抗原和弱激动抗原的信号传递，实现免疫耐受，且不阻碍对外来抗原的反应。但是，缺乏PTPN22的T细胞与弱激动抗原的抗原提呈细胞的结合增强，降低T细胞的激活阈值，促使T细胞活化及其炎性细胞因子的产生。这一结果解释了丧失功能的PTPN22等位基因可使效应T细胞或记忆T细胞群体扩增，促进人类发生自身免疫疾病的倾向。更为重要的是，PTPN22相关等位基因与HLA-DR等位基因具有较强的基因与基因间相互作用，因此，对PTPN22的深入研究将进一步完善对RA发病机制的了解。此外，在RA患者中，CD4+T细胞过度增殖，并分化为效应细胞，产生细胞因子，导致疾病发展。近期有研究指出，与健康人的T细胞相比，RA患者的T细胞由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的上调，致使糖酵解过程产生缺陷。过量的G6PD使葡萄糖分流到磷酸戊糖途径中，导致NADPH(还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)积累和活性氧(ROS)消耗，随着还原当量过剩，T细胞不能有效地激活相关的氧化还原敏感性激酶，绕过G2/M细胞周期的调控关卡，最终过度增殖[14]。除了对CD4+T细胞的研究，在RA患者血清鉴定出T细胞亚群中，过量的Th17细胞介导破骨细胞和滑膜新血管生成，参与RA骨侵蚀过程[15]。研究表明：与健康对照组相比，RA组患者Th17细胞数量增加，与疾病活动呈正相关，与ACPA和RF水平没有明显差异[16]。当RA小鼠模型全身给予唾液酸结合Ig样凝集素-9(sialic acid-binding Ig-like lectin-9，Siglec-9)时，Th17细胞分化减少且Treg细胞增殖，小鼠关节炎症反应和骨损伤得到改善[17]，这些结果证明Th17细胞等亚群失衡可能是RA疾病进展的重要因素。

3.2 中性粒细胞胞外捕获网 中性粒细胞胞外捕获网(NETs)是一种强大的免疫防御机制，可以捕获并杀死细胞外细菌。免疫防御过程中，中性粒细胞排出颗粒复合物(NETs)，其中存储含多种抗微生物酶的松散染色质，负电荷的染色质捕获细菌，利用酶杀死病原体[18]。Khandpur等[19]研究发现，与健康对照组和骨关节炎患者的中性粒细胞相比，在RA患者的循环中检测到高水平的NETs，且浸润滑膜组织、类风湿结节和皮肤；同时，具有高水平ACPA的RA患者的血清中NETs显著升高。这一研究成果表明，RA患者体内可能发生异常的NETs。巧合的是，NETs的形成需要两个主要的生化活动。首先，PTPN22酶的失活被认为是NETs产生的必要条件，这种酶失活可能参与了核包膜的拆除和NETs组件的混合[20]；其次，免疫荧光研究表明，NETs是由DNA和组蛋白等细胞内物质组成，而PAD4可作用于核小体的三种组蛋白，使其含有的精氨酸残基瓜氨酸化，阻止组蛋白甲基化和进一步转录，引起染色质解聚，是NETs形成的中心环节[20-21]，这就恰好解释了RA患者出现高水平NETs的机制。此外，NETs含有重要的PAD沉积物，促进瓜氨酸化产物的形成，血浆NETs水平对早期RA关节炎的诊断显示出高特异度(92%)和敏感度(91%)，NETs已被提出作为RA诊断的一种新型标志物[8]。

3.3 活化的B细胞 B细胞在RA发病机制中的作用已研究和讨论了多年，主要集中在类风湿因子(rheumatoid factor，RF)和免疫复合物方面。目前，RF与ACPA已广泛应用于RA的临床诊断、病情监测及预后评估。近年来，B细胞靶向治疗的临床疗效突出了B细胞在炎性疾病中的致病潜力，探究产生RA特异性自身抗体的B细胞和浆细胞将对RA的临床治疗具有重要意义。最近，有研究对此提供了见解：记忆B细胞亚群富集于RA患者的关节和黏膜相关淋巴组织，以Fc样受体4(Fc receptor like 4，FcRL4)的表达区分记忆B细胞。研究人员从RA患者的滑液和组织中分离单个FcRL4+和FcRL4-B细胞，并鉴定其免疫球蛋白基因，从FcRL4+B细胞产生的重组抗体对瓜氨酸化自身抗原具有较高程度的反应性[22]。FcRL4具有IgA受体的作用，其潜在的黏膜免疫功能，可能是RA患者黏膜和关节炎症的原因之一。鉴定B细胞亚群对RA疾病的靶向治疗可能具有指导性价值。

4 破骨细胞依赖性骨损伤

破骨细胞促进骨吸收，是骨骼生长及愈合过程中重要的一种骨髓细胞。破骨细胞过度活化，导致RA患者骨丢失与关节破坏的观点已被广泛接受，但破骨细胞活化机制尚不明确。位于RA滑膜和骨界面处的多核破骨细胞附近不存在成骨细胞和骨细胞，可吸收骨组织；同时滑膜处的大量促炎症因子，通过激活NF-kB诱导RANKL，有效促进破骨细胞成熟，导致骨侵蚀[23]。另外，在RA疾病早期，PAD的活性增高使成熟破骨细胞中瓜氨酸化自身抗原表达增加，ACPA识别抗原，并激活破骨细胞分泌白介素8(IL-8)，该分子可进一步促进破骨细胞发育和成熟，使破骨细胞激活进入一种类似正反馈的自我循环之中；IL-8通过与CXC趋化因子受体(CXCR1和CXCR2)结合激活感觉神经元，产生关节痛。与此同时，将ACPAs移植到小鼠中，可诱导由IL-8拮抗剂完全逆转的骨丢失[24-25]。由此说明，IL-8很可能是RA破骨细胞活化的主要效应分子，探究这一途径可解释RA患者的骨关节损害倾向。

Tanaka等[23]将来源于RA患者的滑膜细胞放在骨切片上培养，滑膜巨噬细胞分化的多核细胞表现出骨再吸收活性，表明RA滑膜组织为破骨细胞分化提供了有利的微环境[26]。针对破骨细胞的研究，进一步加深了人们对于RA骨损伤的认识。

5 结语与展望

一直以来，RA治疗多采用抗代谢(如甲氨蝶呤)或免疫抑制方案，但由于药物副作用，患者服药依从性普遍偏低，致使病情不断反复甚至恶化。已有研究者利用现有理论探索PAD酶抑制剂、IL-8受体抑制剂、CXC趋化因子受体的变构抑制剂来减轻疾病病情或治愈RA的可能性。随着研究的不断深入，RA的发病机制有望得到进一步揭示，为RA的实验室诊断及临床治疗提供重要的理论依据。