青海地区产共轭亚油酸乳酸菌分离及其对青贮全株玉米品质的影响

陈丽娟，张正友，蔡晓剑，张云华

（1. 安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036；2. 青海大学农林科学院土壤肥料研究所，青海 西宁 810016；3. 安徽农业大学资源与环境学院，安徽 合肥 230036）

共轭亚油酸 (conjugated linoleic acid，CLA)是指含有共轭双键的十八碳二烯酸同分异构体的混合物的天然活性物质，该类物质具有抗癌、预防心血管疾病、减脂等功能作用[1-3]，其中c9，c11-和c10，c12-两种异构体在CLA的生物学功能中具有重要作用[4-5]。CLA来源主要有人工合成和生物体天然合成两种，人工合成CLA含有c9，c11-和c10，c12-两种活性异构体含量较低，同时人工合成存在环境污染及成本较高问题，因此人工合成CLA难以推广使用；而乳制品中c9，c11-可占总CLA含量的73%～93%，牛肉中c9，c11-占总CLA的比例为57%～85%[6-7]。目前人类主要通过摄取反刍动物畜产品牛奶、牛肉等食物来获取部分CLA，但这些天然畜产品中CLA的含量达不到人体理想的需求量[8-10]。因此，研究如何提高畜产品中CLA含量对提升畜产品的品质具有十分重要的科学与实际意义。

畜产品中CLA的含量受动物机体内源酶、消化道微生物作用以及饲料组成成分的影响[11-14]。不同动物体内CLA内源酶的合成或酶活性存在一定的差异，在短时间内很难得以提高。动物消化道存在各种有益的微生物，其中一些微生物参与CLA的合成，但在消化道这样一个稳定的内环境中，很难通过改变某类微生物含量来提高其CLA产量。因此，在饲粮中通过外源添加CLA提高畜产品中的CLA含量具有一定可行性。在母猪饲粮中添加1% CLA，其背部最长肌中CLA的含量显著增加[15]。ISMAIL M M 等[16]利用含有CLA 的饲草每日饲喂奶牛，发现奶牛的生产胎数和产奶量显著提高，同时牛乳中CLA含量也显著增加，有效改善了牛奶品质。但由于纯化CLA的价格昂贵，作为饲料添加剂，CLA在实际生产中很难大量使用。研究表明，外源微生物可以有效利用饲粮中的亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸为底物进行氢化合成CLA[17-18]。因此，利用产CLA的菌株作为青贮菌剂进行青贮以提高青贮饲料的CLA含量，从而提高畜产品的CLA含量是一个切实可行的途径。

青贮饲料微生物共生体系中，乳酸菌数量和种类最多，是影响青贮品质的关键因素之一[19-20]，同时乳酸菌可以利用细胞膜上亚油酸异构酶高效率转化亚油酸获得CLA而被广泛关注[21-22]。这些产CLA的乳酸菌株多来自于泡菜、奶制品、青贮饲料及人和动物的肠道微生物中。Renes等[23]与方丽等[24]分别从传统的泡菜中分离得到产CLA的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)。刘春晓[25]从传统发酵奶油中分离出产CLA的干酪乳杆菌(L. casei)和副干酪乳杆菌(L.paracasei)。杜波等[26]从玉米(Zea mays)青贮饲料中分离出1株产CLA的植物乳杆菌。Dahiya和Puniya[27]从人粪便中分离得到多株产CLA乳酸菌。可见利用产CLA乳酸菌作为青贮菌剂既可以保证青贮品质又可以提高青贮饲料中CLA的产量。此外，相关研究表明，青贮饲料青贮效果与青贮菌剂的适应特性有一定相关性[28]，青海高原地区处于高寒环境，筛选适合该地区环境产CLA的微生物将有助于提高当地青贮饲料的品质和生产效率。

1 材料与方法

1.1 青贮样品及青贮原料

青贮原料为全株玉米，由青海春源畜牧有限公司种植并提供，在乳熟后期收割后使用锤片式粉碎机粉碎至2～3 cm待用。经过测定，全株玉米原料的干物质 ( dry matter，DM )含量为 28.83%，粗蛋白 ( crude protein，CP )含量为 8.98%，中性洗涤纤 维 ( neutral detergent fiber， NDF ) 含 量 42.19%，酸 性 洗 涤 纤 维 ( acid detergent fiber，ADF) 含量24.05%，粗脂肪 ( ether extract，EE )含量 3.76%。

1.2 培养基

MRS 培养基：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母膏 5.0 g、柠檬酸氢二铵 2.0 g、葡萄糖 20.0 g、吐温 80 1.0 mL、乙酸钠 5.0 g、磷酸氢二钾 2.0 g、硫酸镁 0.58 g、硫酸锰 0.25 g、琼脂 18.0 g、蒸馏水1 000 mL、pH 6.2～6.6，121 ℃ 灭菌 15 min。

试剂：亚油酸(LA)和共轭亚油酸(CLA)分别购自Sigma公司；DNA和RNA提取试剂盒购自Invitrogen；细菌通用引物为上海生工合成，其他常规试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 菌株初筛

取自然青贮全株青贮样品200 g，通过四分法将样品缩小至10 g后，将其投入到无菌的烧瓶中，加500 mL无菌生理盐水，充分搅拌后静置30 min，利用无菌纱布将该生理盐水过滤到另一无菌烧杯中，并按10倍稀释法将过滤后的液体进行等梯度稀释。随后分别从每个梯度洗脱液中吸取适量液体放置于MRS培养基上，并涂均匀。37 ℃培养72 h后，挑选单个菌落进行平板划线分离，直至出现完整的单菌落并保存该菌株。

1.4 菌株复筛

产CLA微生物以亚油酸为底物将其转化为CLA，CLA在233 nm处的紫外区有特征吸收峰，因此用紫外分光光度计在该波长下扫描检测样品，在233 nm处有特征吸收峰即表明被检查样品中含有CLA，暗示接种到培养基中的菌株具有将亚油酸转化为CLA的功能，即可确认该菌具有产CLA的能力。

将初筛所得菌种按5%接种量接种于10 mL含有亚油酸的MRS液体培养基中，培养基中亚油酸浓度为0.5 g·L-1。以不接入菌种、其他条件相同的发酵培养液为空白对照，37 ℃静置培养 72 h，使用紫外可见分光光度计(SP-756)在波长233 nm进行扫描。

1.5 菌株鉴定

形态学鉴定：采用稀释平板法，在MRS培养基中培养获得单菌落，取生长良好的菌落，在菌落表面滴几滴3%的戊二醛固定液在4 ℃下固定2 h。用DEPC水浸泡过的铁勺轻刮菌体于灭菌过的 2 mL 离心管，10 000 r·min-1离心 2 min 后换入新的3%戊二醛固定4 h。将固定后的菌体加入0.1 mol·L-1的PBS 缓冲液 (pH 7.2，下同)中，清洗3遍，每次 20 min。用30%、50%、70%、80%、95%、100% 共6种浓度的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度在4 ℃下处理20 min，置换到100%丙酮(或乙酸异戊酯)中，4 ℃，两次，每次20 min。临界点干燥处理，镀膜，扫描电镜观察其表面形态变化。

分子生物学鉴定：参照CTAB法提取，提取菌株中总DNA。以提取的菌株DNA为模板，细菌16S rDNA通用引物为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'进行扩增。反应体系：Taq DNA Polymerae (5 U·µL-1)为 0.25 µL；5 × Taq Buffer为 10 µL；dNTP 为 1 µL；模板为 2 µL；上下游引物各2 µL；ddH2O补至50 µL。细菌反应条件：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性 45 s，55 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，35 个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保温。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后用2%的琼脂糖凝胶回收目的条带，使用胶回收试剂盒纯化后，送至上海生工测序。利用NCBI网站的在线Blast软件对进行同源性对比。

1.6 全株玉米青贮处理

青贮试验共设置5个处理，对照组不接种青贮菌剂(接种量为0)，不产CLA的植物乳杆菌设置两个浓度 (LP-1：接种量为 1 × 105cfu·g-1；LP-2：接种 量 为 1 × 106cfu·g-1)， 产 CLA 的 植 物 乳 杆菌ANCLA2分别设置两个浓度(ANCLA2-1：接种量为1 × 105cfu·g-1；ANCLA2-2：接种量为1 × 106cfu·g-1)，每个处理3个重复，分别装入2.5 kg的厌氧发酵袋中，抽真空，密封，室温保存40 d。

1.7 样品采集及分析

饲料样品采集：开袋后将样品充分混合，采用四分法采集全株测定饲料中营养物质的含量。全株玉米青贮后根据气味、pH、色泽和质地等方面进行感官评价，随后测定乳酸 ( lactic acid，LA)、乙 酸 (acetic acid，AA)、 丙 酸 (propionic acid，PA)和 丁 酸 (butyric acid，BA)及 氨 态 氮(ammonia nitrogen，NH3-N)含量、干物质、粗脂肪、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和共轭亚油酸。

感官评价指标：参考重庆地方标准DB-50T 669-2016青贮饲料品质鉴定，根据青贮的气味(1-25分)、质地 (1-10分)、pH(1-25分)、色泽(1-20分)和水分(1-20分)进行评分。综合5项得分，评定为优等(100-72分)、良好(71-37分)、一般(36-11分)和劣质(≤ 10分)4个等级。

LA含量和挥发性脂肪酸(AA、PA和BA)及NH3-N含量测定：参照张亚格等[29]的方法对样品进行测定前制备，参照张淑枝等[30]的方法测定LA含量，参照Shao等[31]的方法采用高效气相色谱仪(Agilent 1260)测定挥发性脂肪酸含量，参照Weatherburn[32]的方法采用苯酚－次氯酸钠比色法测定NH3-N含量。

采用索氏抽提法测定EE含量，采用凯氏定氮法测定CP含量，在范氏法(Van Soest)的基础上使用滤袋分析法测定NDF和ADF含量，使用pH计测定pH。

CLA测定：以正己烷为溶剂，将CLA标准品配成不同浓度的溶液，以正己烷为参比，在233 nm处测定其吸收值，以CLA的质量浓度 (pg· mL-1)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。发酵液中CLA的提取及测定按薛秀恒等[33]的方法操作。将所获得脂肪酸提取物用5 mL正己烷溶解，以不接种的发酵液提取物为参比，测其吸收值，根据标准曲线计算发酵液中CLA的含量。

1.8 数据统计与分析

采用SPSS 17.0软件对所测数据统计分析，用平均值和标准误表示测定结果，分别对不同菌剂处理进行单因素方差分析，并用Duncan法对各测定数据进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 菌株形态学和分子生物鉴定

菌株在MRS固态培养基中培养48 h后，菌落凸起，表面光滑，呈圆形，乳白色(图1A)。扫描电镜观察分离菌株呈现杆状，两端为圆形，无芽孢(图1B)。根据《伯杰细菌鉴定手册》[34]，初步鉴定该菌属于杆菌细菌。菌株16S rDNA测序结果在NCBI中进行同源性比较分析，发现该菌株16 S rDNA 与 L. plantarum strain 10CH 的 16S rDNA 相似度为98%。分子生物学鉴定结果与形态学观察结果一致，确定该菌为植物乳杆菌，命名为ANCLA2。

图1 ANCLA2菌株形态学鉴定Figure 1 Morphological identification of the ANCLA2 strainA：ANCLA2 菌落在MRS中形态特征；B：ANCLA2扫描电镜形态特征。A： The colony characteristics of the ANCLA2 strain on the MRS；B：The structure characteristics of the ANCLA2 strain in the SEM.

2.2 ANCLA2处理对全株玉米青贮感官品质影响

试验主要从色泽、气味、水分和质地4个方面对对照组和试验组全株玉米进行感官评定(表1)。对照组香味较弱，刺鼻味，有微褐色存在，呈湿润状态，结构清晰，等级为良好。试验组LP-1、LP-2、ANCLA2-1和ANCLA2-2青贮料颜色均呈现有光泽绿色，均有芳香酒酸味，呈蓬松、湿润状态，质地清晰，结构保持良好。但LP-2组绿色略强于LP-1组，同样ANCLA2-2组绿色略强于ANCLA2-1组，试验组的pH均低于对照组。综合评分试验组均高于对照组，试验组均在优质范围内，对照组在良好级别。

表1 ANCLA2处理对全株玉米青贮感官品质影响Table 1 Effect of ANCLA2 on organoleptic properties of whole corn silage

2.3 ANCLA2处理对全株玉米青贮品质影响

青贮40 d之后，ANCLA2-2组乳酸含量显著高于 ANCLA2-1 处理组 (P＜0.05)，同时 LP-2 处理组乳酸含量显著高于LP-1组(P＜0.05)，对照组乳酸含量最低，处理组间ANCLA2-2组的乳酸含量高于LP-2组，但差异不显著(P ＞ 0.05)(表2)。乙酸含量 ANCLA2-1 组产量显著高于其他组 (P＜0.05)，对照、LP-1、LP-2和ANCLA2-2组之间无显著差异(P ＞ 0.05)。对照组和ANCLA2-1组丙酸含量显著高于其他组 (P＜0.05)，ANCLA2-2 和 LP-2 处理组的丙酸含量显著低于其他处理组(P＜0.05)，但ANCLA2-2 和 LP-2 处理组间差异不显著 (P ＞ 0.05)。对照组检测到微量丁酸，其他组无丁酸产生。对照组氨态氮占总氮比显著高于试验组(P＜0.05)，试验组LP-1氨态氮占总氮比显著高于LP-2组(P ＜0.05)，ANCLA2-1氨态氮占总氮比显著高于ANCLA2-2组 (P＜0.05)，LP-1 和 ANCLA2-1 组间氨态氮占总氮比差异不显著 (P ＞ 0.05)，LP-2 和 ANCLA2-2组间氨态氮占总氮比差异不显著(P ＞ 0.05)。

2.4 ANCLA2全株玉米青贮营养成分影响

全株玉米青贮后，对照组干物质含量显著高于试验组 (P＜0.05)，LP-1 和 LP-2 处理组干物质含量差异不显著 (P ＞ 0.05)，ANCLA2-1 处理组干物质含量显著高于 ANCLA2-2 (P＜0.05)，ANCLA2-2 处理组干物质显著低于 LP-1和 ANCLA2-1 组 (P＜0.05)(表3)。ANCLA2-2和LP-2处理组粗蛋白含量无显著差异 (P ＞ 0.05)，但显著低于其他处理组 (P ＜0.05)。对照组NDF含量显著低于试验组(P ＜0.05)，ANCLA2-1处理组NDF含量显著高于其他3个试验组(P＜0.05)，其他3个试验组间无显著差异(P ＞ 0.05)。对照组ADF含量显著低于其他处理组(P＜0.05)，试验组之间ADF含量无显著差异(P ＞ 0.05)。ANCLA2-2 处理组粗脂肪含量显著高于其他处理组(P＜0.05)，试验组粗脂肪含量显著高于对照组 (P＜0.05)，LP-1 和LP-2 组粗脂肪含量差异不显著(P ＞ 0.05)。对照组CLA含量显著低于其他试验组(P＜0.05)，ANCLA2-2组CLA 含量显著高于其他处理组 (P＜0.05)，LP-1 和 LP-2 间无显著差异 (P ＞ 0.05)。

表2 ANCLA2处理对全株玉米青贮发酵品质影响Table 2 Fermentation sensory quality of whole corn silage

3 讨论

青贮菌剂是制作优质青贮饲料的保证，但目前青贮菌剂的添加主要是为了促进发酵，提高乳酸浓度、迅速降低青贮料pH，抑制丁酸和氨态氮的生成[35-36]，而在具有普通青贮菌剂功能的基础上挖掘具有特定功能性青贮菌剂可为新型畜产品饲料的开发提供新方向。杜波等[26]从南方青贮饲料中分离到一株产CLA菌株，该菌株具有较好的产CLA能力。但在以畜牧为主产业的青海地区，由于环境温度较低，外源菌剂难以适应高寒环境，导致饲料青贮后在短时间内不易使温度上升到30 ℃。而如果短时间内青贮温度达不到微生物生长繁殖的要求，一些腐败菌就会快速繁殖，从而影响青贮饲料品质[37-38]。因此，分离适应青海高寒地区的产CLA青贮微生物具有重要意义。本研究从青海高寒地区自然青贮玉米中成功分离得到产CLA植物乳杆菌ANCLA2。用该菌反接回全株玉米中青贮后，青贮玉米的pH低于对照组，感官评定属于优质，而对照组属于良好。青贮中pH的高低与乳酸、乙酸及丙酸含量有一定相关性，试验结果表明全株玉米接种ANCLA2菌后，青贮中乳酸含量提高，丙酸含量显著低于对照组，但乙酸含量除ANCLA2-1组高于其他组，其他各组之间无显著差异。这与Srigopalram等[39]将乳酸菌接种到意大利黑麦草(L. multiflorum)青贮后，青贮料pH显著降低结果相似。Xu等[40]利用L. brevis和 L. parafarraginis青贮玉米秸秆，青贮pH显著降低，乙酸含量增加。氨态氮和丁酸的生成与pH的高低有一定相关性。贾婷婷等[41]将植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和布氏乳杆菌(L. buchneri) 3种乳酸菌分别接种到燕麦(Avena sativa)中青贮，燕麦青贮饲料的pH、丙酸和氨态氮含量显著低于对照组。侯建建等[42]利用高浓度植物乳杆菌处理的苜蓿(Medicago sativa)青贮饲料表现出高乳酸，低氨态氮，低pH，与本研究表现一致。本研究结果显示，试验组ANCLA处理组和LP处理组的氨态氮和丁酸的含量均低于对照组，试验组中有害微生物得到有效抑制。

表3 产CLA乳杆菌菌剂处理对全株玉米青贮营养成分影响Table 3 Fermentation quality of whole corn silage

本研究中试验组LP-1和ANCLA2-1处理组粗蛋白含量低于对照组，但无显著差异(P ＞ 0.05)，随着菌体LP和ANCLA2接种量增加，试验组粗蛋白含量显著低于对照组(P＜0.05)。主要是青贮过程中由于微生物需要营养(如能量和蛋白质等各种物质)来维持自身的生长，会导致青贮原料中糖、淀粉和蛋白等营养物质的损失，而菌体蛋白的增长量不足以弥补青贮原料蛋白损失，导致青贮后蛋白含量降低[36]。Sucu等[43]报道，玉米青贮后蛋白含量降低，与本研究结论相似。但Hoffman和Funk[44]在研究青贮时间和接种量对玉米蛋白质的影响报道中发现，青贮后蛋白含量无显著差异(P ＞ 0.05)。不同研究的青贮后蛋白质变化差异可能与青贮原料，青贮时间，菌种种类及接种量等有关。玉米等农作物秸秆的主要组成是纤维素、半纤维素和木质素，其中木质素将纤维素和半纤维素层层包裹，同时纤维素的基本组成单位是纤维二糖，因此，青贮后纤维含量的降低就存在青贮微生物分泌相关的纤维降解酶对相关纤维进行降解。侯美玲等[45]报道，乳酸菌也可显著降低试验组中牧草的NDF和ADF含量。但本研究中，青贮前后中性洗涤纤维，酸性洗涤纤维均显著性高于对照(P＜0.05)，可能是由于本研究中全株玉米干物质损失量高于纤维的降解。

青贮前后粗脂肪含量的变化主要是由于参与青贮微生物能够利用系统中营养物质合成粗脂肪，王启芝等[46]报道，米曲霉可以提高玉米秸秆青贮后粗脂肪含量，同样本研究ANCLA2处理组中粗脂肪含量显著高于对照组(P＜0.05)，可能与青贮后干物质降低、同时ANCLA2菌促进粗脂肪的合成有关。ANCLA2处理组的CLA含量显著高于对照组和LP处理组(P＜0.05)，主要是全株玉米中存在大量的不饱和脂肪酸，ANCLA2菌株可以利用该不饱和脂肪酸进行CLA转化，从而提高了青贮后CLA含量。

4 结论

从青海地区青贮饲料中选育获得产CLA的细菌为植物乳杆菌，并被命名为ANCLA2。从感官角度评价该菌青贮全株玉米效果和常规植物乳杆菌青贮效果相当，能有效提高青贮饲料中的乳酸和乙酸含量，降低青贮饲料的pH且抑制了青贮饲料中的氨态氮含量；但ANCLA2菌较高程度地降低了全株玉米干物质含量，且随着接种量增加，干物质损失量提高；ANCLA2菌青贮后全株玉米粗蛋白含量降低，NDF含量显著高于对照组和LP处理组，ADF含量高于对照组，粗脂肪和CLA含量高于其他处理组。ANCLA2菌在保证全株玉米青贮效果的同时，能提高粗脂肪和CLA含量。