MicroRNA-92a在胰腺癌中的表达及对肿瘤生长的影响

许勇，李波 ，林强 ，钟昌桃，刘东 ，程愿 ，钟云昌

（1.西南医科大学附属医院 肝胆外科，四川 泸州 646000；2.自贡市第三人民医院 肝胆外科，四川 自贡 643000；3.自贡市第四人民医院 肝胆外科，四川 自贡 643000）

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）是人类病死率最高的消化系统恶性肿瘤之一[1]。MicroRNA是一类长度在25个碱基以内的单链RNA[2]。microRNA-92a（miR-92a）是近年来新鉴定的出的一种microRNA，它在胃癌[3]、肝癌[4]及乳腺癌[5]中的表达水平上调并能促进肿瘤细胞生长及侵袭，提示miR-92a是一种潜在的促癌基因。目前，PDAC中miR-92a的表达量以及与临床表现的关系尚未可知。本课题研究PDAC中miR-92a的表达情况，同时探讨高表达miR-92a后胰腺癌细胞增殖以及凋亡的变化。

1 资料与方法

1.1 组织标本、细胞及试剂

选取2014年1月—2016年1月于西南医科大学附属医院肝胆外科收治并行手术切除的50例PDAC组织标本及对应癌旁组织标本（距肿瘤切边缘＞2 cm）。其中，男性35例，女性15例；年龄40～68岁。所有患者术前均未进行过放化疗及肿瘤辅助治疗。所有标本于离体0.5 h内取材，于液氮中固定保存。

胰腺癌PANC-1细胞购自中科院上海细胞库并由本院实验室保存，miR-92a抑制性慢病毒颗粒（病毒载体类型：psi-LVRH1GP）购自广州复能基因公司，DMEM（11965-084）、胎牛血清（16000044）均购自美国Gibco公司，Annexin V凋亡检测试剂盒（FITC/PI双染法，E606336）购自生工生物工程（上海）股份有限公司，Trizol试剂（15596026）、逆转录PCR（reverse transcription PCR， RT-PCR）试剂盒（Super Script ® One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA Polymerase, 10928042）及实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）试剂盒（DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit, F415L） 均 购自美国Invitrogen公司，兔抗人DAB2IP多克隆抗体（ab87811）购自美国Abcam公司，兔抗人β-actin单克隆抗体（#4970）购自美国CST公司，兔SP免疫组织化学（以下简称免疫组化）试剂盒由武汉博士德生物技术有限公司提供。

1.2 miR-92a基因相对含量的检测

通过Trizol试剂提取标本及细胞RNA，配制逆转录及PCR扩增体系。设置逆转录条件：50℃逆转录30 min，94℃变性2 min，循环次数1次；94℃变性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，循环次数40次；72℃最终延伸10 min。通过2-△△Ct法检测miR-92a基因的相对含量。

1.3 细胞培养及慢病毒感染

PANC-1于适宜环境中培养，稳定传代2～3代后进行实验。将PANC-1细胞过夜增殖至融合度达70%，接种6孔细胞培养板。达到预定培养密度后移除培养基，1×PBS溶液充分洗涤细胞。慢病毒感染分组：miR-92a抑制性慢病毒（anti-miR-92a）组每孔加入1 ml的miR-92a抑制性慢病毒上清液、2 ml完全培养基及15 μg聚凝胺（ploybrene）；对照组（anti-miR-con）每孔加入1 ml的阴性对照慢病毒上清液、2 ml完全培养基及15 μg ploybrene。转染48 h后，使用含2 μg/ml嘌呤霉素（puromycin）的完全培养液筛选稳定转染细胞株。

1.4 平板克隆形成实验检测细胞增殖

PANC-1细胞按500个每孔均匀接种于6孔板中，每周更换完全培养基2次。培养2周后，使用4%多聚甲醛固定细胞30 min，1%结晶紫染色15 min，置于蒸馏水中洗去多余染液。风干后将6孔板置于网格纸上计数每孔克隆形成数量，计算克隆形成率。每个样本独立重复实验3次。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

PANC-1细胞用预冷PBS工作液冲洗2次，胰酶消化细胞后1 500 r/min离心5 min沉淀细胞，预制缓冲液调整细胞数为1×106个/ml，将500 μl细胞悬液与5 μl Annexin V-FITC及10 μl PI混合，室温遮光反应10 min后上机测试。

1.6 裸鼠皮下移植瘤模型复制

10只5周龄BLAB/c裸鼠，随机分为anti-miR-92a组和anti-miR-con组，每组5只，分组后适应性饲养1周。分别取对数生长期的miR-92a敲除细胞及阴性对照细胞，以冷PBS溶液制成细胞悬液，调整终浓度为2.0×107个/ml。使用1 ml注射器，将0.2 ml细胞悬液（约含4.0×106个细胞）接种于裸鼠背部近右下肢处皮下组织内，复制裸鼠皮下成瘤模型。裸鼠饲养4周，每周测量肿瘤长度及宽度，按公式1/2（长轴×短轴2）来计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。

1.7 western blotting检测DAB2IP蛋白表达

通过RIPA试剂提取细胞总蛋白，凝胶垂直电泳分离蛋白，70 V恒压转膜150 min，5%牛血清白蛋白封闭1 h后将条带孵育于1∶1 000比例稀释的DAB2IP和β-actin一抗中。4℃过夜后，使用1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记二抗孵育条带1 h。ECL法曝光条带。

1.8 免疫组化染色检测DAB2IP蛋白表达

组织切片常规预处理后滴加1∶100稀释的DAB2IP抗体，4℃孵育过夜。清洗残余一抗后，使用HRP标记的二抗结合对应的一抗，DAB法显色。按文献[6]所述方法，计算每张切片的免疫组化得分。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验或重复测量设计的方差分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-92a在PDAC组织中的表达情况

miR-92a在PDAC组织中的表达水平（1.458±0.023）与癌旁组织中的表达水平（0.418±0.037）比较，差异有统计学意义（t=4.832，P=0.000），PDAC组织高于对应癌旁组织。

2.2 miR-92a的表达与临床病理特征的关系

PDAC组织中miR-92a高表达患者的肿瘤直径较miR-92a低表达者更大（χ2=6.256，P=0.012）。

2.3 在体外下调miR-92a表达对PANC-1细胞增殖凋亡的影响

感染anti-miR-92a慢病毒的细胞内miR-92a的表达水平较anti-miR-con组降低，差异有统计学意义（t=4.439，P=0.041）（见图1A）。平板克隆实验结果显示，anti-miR-92a组克隆形成率为（35.13±7.81）%，低于anti-miR-con组的克隆形成率（86.25±8.19）%，差异有统计学意义（t=5.452，P=0.033）（见图1B）。同时下调miR-92a表达后，PANC-1细胞凋亡（37.14±4.51）较anti-miR-con组（12.35±3.64）升高（t=5.840，P=0.029）（见图 1C）。

2.4 下调miR-92a表达后对裸鼠皮下移植瘤生长的影响

两组皮下注射肿瘤细胞后不同时间点的肿瘤体积比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的肿瘤体积有差异（F=8.108，P=0.013）。②两组肿瘤肿瘤体积有差异（F=10.034，P=0.009），anti-miR-92a组肿瘤肿瘤体积较anti-miR-con组小，miR-92a有抑制肿瘤生长作用。③两组的肿瘤体积变化趋势有差异（F=7.056，P=0.022）（见图2A）。在饲养4周后anti-miR-92a组的最终肿瘤体积较anti-miR-con组下降（t=3.081，P=0.014）（见图 2B、C）。

图1 下调miR-92a表达对PANC-1细胞增殖、凋亡的影响

2.5 下调miR-92a表达对DAB2IP表达的影响

沉默miR-92a抑制PANC-1细胞内DAB2IP mRNA（t=4.427，P=0.040）及蛋白的表达水平（t=5.002，P=0.036）；同时下调miR-92a表达的移植瘤组织内DAB2IP蛋白的表达水平也降低（t=3.161，P=0.013）。见图3。

图2 下调miR-92a表达对PANC-1细胞移植瘤生长的影响

图3 下调miR-92a表达对DAB2IP表达的影响

3 讨论

本研究结果显示，PDAC组织中miR-92a的表达水平高于癌旁组织。提示miR-92a在胰腺癌中可能是一种被上调的促癌因子。不同的体外及体内研究表明，抑制miR-92a的表达能够削弱细胞增殖并促进细胞凋亡。在动物实验中，也发现抑制miR-92a表达的PANC-1细胞在体内抑制肿瘤细胞的生长。miR-92a可能是一种具有多项促癌功能的microRNA，最新文献也指出，miR-92a也具有促进肿瘤转移[7]及增强化疗抵抗[8]的作用。类似报道的结果值得大家在今后的工作中进一步深入研究miR-92a的生物学功能。

MicroRNA能够通过结合靶基因3'-UTR区而发挥负向调控作用。笔者通过生物信息学检索分析发现，凋亡诱导因子DAB2IP mRNA的3'-UTR区存在miR-92a的结合位点。既往研究[9]也表明，DAB2IP在胰腺癌细胞内表达降低且具有抑癌作用，其可能是miR-92a的潜在靶点之一。通过PCR及Western blotting发现，下调miR-92a在体外能促进DAB2IP的表达，进一步通过免疫组化发现沉默miR-92a表达的移植瘤组织中DAB2IP的表达也出现恢复性升高。研究指出，DAB2IP能够下调包括Ras-Raf-ERK[10]和PI3KAkt[11]在内的许多促进肿瘤细胞生长的信号通路的活性。提示miR-92a的促进肿瘤生长作用可能是与解除DAB2IP对多条激酶信号通路的抑制有关。

综上所述，miR-92a在胰腺癌中高表达，沉默miR-92a可能通过恢复DAB2IP的表达而抑制胰腺癌细胞生长。