肺纤维化机制的研究进展

何 巧 综述，熊 简 审校

(重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科 400016)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是肺纤维化的最常见形式，许多研究表明IPF的发病率和患病率正在增加，IPF与高龄密切相关。IPF男性与女性患者比例通常接近2∶1。各种病例对照研究已经确定吸烟，暴露于烟草烟雾、金属粉尘、木屑、二氧化硅、灰尘、饲养牲口等职业/环境，病毒感染、病理性胃食管反流与IPF风险增加有关。然而，许多IPF患者似乎没有任何与疾病风险相关的风险因素，风险因素需要个体具有遗传易感性以响应诱导损伤，而发展成肺纤维化。呼吸衰竭是IPF患者常见的死亡原因，冠状动脉疾病并发症、 肺栓塞或肺癌也是其死亡原因。

肺纤维化的病理学过程研究发现，早期致病因子对血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的弥漫性损伤，引起肺泡炎症，因免疫介导的肺部炎症持续存在,以及一系列免疫相关因子通过各种信号转导途径扩大组织损伤，大量成纤维细胞聚集，驱动胶原和其他细胞外基质(ECM)异常沉积和组织收缩，正常的肺泡组织受损，异常修复导致结构异常和功能障碍[1]。上述过程同时存在，互相影响，导致肺的进行性瘢痕形成，最终发展成为广泛的纤维化变化。5年生存率仅20%[2]。大量研究表明，目前抑制免疫炎性反应的治疗策略并非对所有肺纤维化疾病有效[3-4]。甚至可能对IPF患者有害。近年来对IPF的病理学研究重点发生变化，以前定义为炎症性疾病，目前认为IPF是上皮驱动的疾病。尽管如此，免疫和自身免疫过程仍可能在IPF的发病机制中发挥重要作用。由于IPF与高龄密切相关，包括端粒缩短，基因组不稳定性和表观遗传突变[5]，细胞衰老和衰老细胞积累，异常的细胞通信，线粒体功能障碍，干细胞衰竭，氧化应激的累积效应和蛋白质组稳态的破坏。现将概括在IPF中起重要作用的细胞，其中细胞因子、遗传、衰老与肺纤维化的相关性有所提及，为肺纤维化发病机制的研究和治疗提供新思路。

1 肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells,AECs)

AECs参与肺纤维化机制为：遗传易感性、年龄相关因素及触发因素相结合引发上皮损伤，重复的上皮细胞损伤/应激/凋亡和随后的异常修复反应和基质积累，导致进行性纤维化和肺功能随时间逐渐丧失[6-7]。

AEC1s的损伤和AEC层的破坏被作为IPF发病机制的起始事件。早期AEC1s在博来霉素(BLM)诱导大鼠肺严重受损，基底膜暴露，激活和聚集血小饭，引起血液凝固过程，产生一些物质以增加毛细血管渗透性，使炎性细胞和炎性介质进入肺间质[8]。AEC1s的损伤和AEC层的破坏之后是AEC2s的增殖和分化，以构建正常组织结构，AEC2s功能障碍在肺异常修复损伤中起关键作用。反复上皮细胞损伤后的组织重塑不能重建正常上皮屏障，不能抑制肌成纤维细胞的异常行为与增殖及循环纤维细胞进入肺组织。

AECs还可以通过上皮-间充质细胞的转化(EMT)分化为成纤维细胞,EMT是AEC2s的分子重编程，其典型标记是α平滑肌肌动蛋白(αSMA)，降低非编码小RNA分子let-7d的水平可促进EMT的转化[9]。

AECs参与肺纤维化的其他机制:线粒体DNA损伤与AECs凋亡和肺纤维化的发生密切相关，其与BLM诱导小鼠肺损伤中增加的活性氧物质(ROS)水平相关[10]。肺纤维化疾病存在基因调控(AECs周期的异常基因调控及细胞凋亡)与环境压力相结合的遗传倾向[11]。有研究已经在IPF肺组织中发现，p53途径的破坏可以促进细胞周期停滞和不适当的上皮细胞凋亡，但在其他肺纤维化疾病中没有发现[12]。PTEN是一个肿瘤抑制基因，一些研究表明，PTEN/NF-κB途径调控衰老的AEC可促进成纤维细胞中胶原的积累，导致肺纤维化。作为IPF的初始阶段，AEC的衰老过程可能是潜在的治疗靶点。

2 血管内皮细胞(endothelial cells,EC)

在肺纤维化早期阶段肺微血管内皮细胞(PMVECs)参与肺纤维化的发展变化过程[13]，随着基底膜的破坏，肺泡结构的损伤和AEC的丧失累及肺泡血管并导致EC增生及血管通透性增加。EC增生促进新生毛细血管形成，从而聚集大量AECs，大量纤维蛋白增生及胶原沉积。同时其分泌黏附分子让单核细胞和淋巴细胞易于附着在EC表面，有利于炎性细胞和免疫效应细胞的浸润。有研究显示，大多数肺纤维化期间PMVECs中的紧密连接(TJ)在BLM处理的组织中处于开放状态[14]。这种细胞旁病变的功能障碍直接导致白细胞的浸润呈连续性，加重肺纤维化。内皮细胞-肌成纤维细胞转化(EndoMT)是在BLM诱导的大鼠肺纤维化过程中发现的，在维持炎症和胶原蛋白分泌中起着非常重要的作用。α-SMA可以用作于EndoMT的蛋白质标记物。已经发现BLM诱导的大鼠PMVECs中上调α-SMA、Notch1和Jagged1的表达水平，而Dll4的表达下调。此外，PMVECs中Jagged1和α-SMA蛋白的表达呈正相关，而Jagged1的表达下调导致NF-κB下调，其具体机制尚需进一步研究。

3 肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)

炎症状态在各种原因引起的肺损伤的早期阶段明显，而肺纤维化发展的晚期相反[15]，这可能是传统的抗炎疗法治疗肺纤维化失败的重要原因。虽然现在IPF侧重于上皮损伤机制，但在肺纤维化病理学研究中仍能发现炎性反应及免疫介导。在BLM诱导肺损伤动物模型早期阶段，炎性细胞浸润主要以AM为主。炎症期间AM分化为替代活化状态(M2表型)可导致成纤维细胞的过度增殖并促进纤维化形成。在BLM诱导肺损伤动物模型中观察到：Wnt共受体Lrp5促进Wnt/β-连环蛋白信号传导，进一步促进AM分化为拮抗肺纤维化分解的亚型；Lrp基因敲除小鼠可促进纤维化的分解，减轻纤维化进展[16]。

4 中性粒细胞

支气管肺泡灌注液(BALF)中增多的中性粒细胞与肺纤维化的早期死亡率增加有关。若损伤持续存在，继AM后，中性粒细胞被招募致损伤部位。来自环境的不同刺激可以在炎症部位对中性粒细胞产生趋化活性。系统外渗到组织中的白细胞是被炎症趋化因子诱导的，与中性粒细胞最相关的趋化因子受体是CXCR1、CXCR2。粒细胞趋化蛋白-2 (GCP-2/CXCL6)作用于CXCR1、CXCR2两种趋化因子受体，在趋化中性粒细胞、促进血管生成中有着重要作用。BLM致肺损伤中，使用CXCR2受体拮抗剂、抗GCP-2[17]、抗CXCL-8[18]治疗可减少肺实质中的中性粒细胞，减少胶原沉积。

中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)通过破坏肺的通透屏障功能，刺激促炎细胞因子和生长因子血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)的释放，参与肺纤维化的炎症期。在肺纤维化小鼠中，NE抑制剂可减少中性粒细胞堆积和胶原沉积，降低转化生成生因子-β1(TGF-β1)的活化，已在临床上有效治疗急性肺损伤及肺部炎症[19]。其在肺纤维化中的治疗作用尚需进一步研究。中性粒细胞如何与其他免疫成分合作，对中性粒细胞关键途径的治疗策略需进一步探索。

5 淋巴细胞

IPF患者在BALF和肺实质中均发现免疫球蛋白水平升高和存在免疫复合物。因此，IPF被认为具有在肺组织中的异常免疫应答。某些淋巴细胞因子被认为是促纤维化的，对成纤维细胞和肌成纤维细胞活性有直接影响。CD4+T辅助细胞在受抗原刺激后，分化成Th1/Th2效应细胞亚群，Th2亚群典型的白细胞介素(IL)是IL-4,可诱导IL-5，IL-13和TGF-β1水平增加，募集巨噬细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞和间充质细胞，并直接诱导成纤维细胞活化，Th2细胞型细胞因子占主导地位可导致纤维化[20]。转录因子GATA3在肺纤维化中显著升高，其主要在淋巴细胞中表达，可能的机制是GATA3仅在Th2中表达，体现Th2类细胞因子的主导地位[21]。

淋巴细胞的作用仍有争议。例如以下两种T细胞：一方面有学者发现Th17细胞(以产生IL-17为特征的T细胞)对纤维化没有直接影响。另一方面，有研究发现IL-17在肺纤维化中表达增加，且与病情的严重程度呈正相关[22]，阻断、中和IL-17A可以延缓肺纤维化的进展并促进其缓解[23]。调节性T细胞(Tregs)是一类新的对炎性反应起拮抗作用的CD4+T细胞亚群，在肺纤维化早期通过增加TGF-β1释放和胶原沉积达到促纤维化作用，而在晚期，Tregs可通过抑制成纤维细胞生长因子(FGF)-9和CXC趋化因子配体(CXCL)12减弱纤维细胞募集和肺纤维化[24]。可见Treg可能同时具有抗纤维化和促纤维化的作用，取决于肺纤维化的阶段及与其他T细胞亚型的相互作用。另有学者发现肺纤维化具有自身免疫紊乱特征，存在Th17/Treg细胞失衡现象[25]。与健康人和患有其他肺病的患者相比，在IPF患者的BALF和外周血中，CD4+CD25+FOXP3+Tregs的数量减少，可用于IPF患者诊断的生物学标志细胞，有待进行前瞻性研究明确其临床意义。

6 肥大细胞

肥大细胞被认为参与各种组织、器官的纤维化过程。将分离和纯化的大鼠腹膜肥大细胞(PMC)与同源胚胎肺成纤维细胞(LFb)一起培养，结果显示PMC可促进LFb增殖和活跃。IPF患者的肺组织肥大细胞数量增加，其细支气管灌洗含有比对照组更高浓度的组胺，与纤维化的严重程度相关。肥大细胞可以由趋化因子和生长因子募集，通过分泌各种细胞因子和生物活性物质诱导成纤维细胞增殖，合成和分泌胶原蛋白，参与肺纤维化进程[26]。肥大细胞和成纤维细胞之间的CADM1依赖性相互作用促进肥大细胞活化和存活。

碱性成纤维细胞生长因子作为IPF患者肺纤维化的关键介质，主要来源于肥大细胞。结缔组织生成因子(CTGF)在肺肥大细胞中具有免疫阳性信号，表明肺中的肥大细胞也是肺纤维化期间肺中CTGF增加的机制[27]。

7 间充质细胞

间充质细胞，特别是成纤维细胞和肌成纤维细胞的作用对IPF发病机制至关重要。AEC损伤和细胞凋亡、凝血途径的激活及异常的伤口修复机制，可直接募集成纤维细胞，通过转分化和增殖而逐渐破坏肺基质，进一步导致肌成纤维细胞的激活和积聚。成纤维细胞是肺中Ⅰ型胶原蛋白的主要来源,而Ⅰ型和Ⅲ型胶原的比例不平衡，导致胶原沉积和肺纤维化。AEC经过EMT是否可以被认为是肌成纤维细胞，仍然存在争议。肌成纤维细胞比成纤维细胞合成更多的ECM。

通过全基因组关联研究(GWAS)和IPF患者中mRNA表达模式的各种分析显示，与肺发育相关的胚胎学途径(例如Wnt、PTEN/PI3激酶/Akt、hedgehog和TGF-β信号通路)和表观遗传因素在修复应答和肌成纤维细胞激活中起重要作用[28]。DNA甲基化为表观遗传学现象之一，Thy-1启动子中DNA的高甲基化导致IPF肺成纤维细胞中Thy-1的表达降低，随之可造成肌成纤维细胞的不受控制的生成和疤痕形成[29]。组蛋白乙酰化的改变可影响与纤维化和(或)凋亡相关的基因(例如Fas-配体，环加氧酶2和CXCL-10)的表达，导致IPF成纤维细胞变得对凋亡具有抗性[30]。

8 肺纤维化中关键因子

许多专家认为IPF发病机制以Ⅰ型肺泡上皮细胞的损伤和AEC层的破坏作为起始事件，其后促纤维化细胞因子释放激活上皮细胞和成纤维细胞，产生过量胶原蛋白，造成肺组织不可逆损伤。

有假设提出，由于呼吸引起的细胞外细胞基质拉伸可能通过TGF-β激活促进肺纤维化疾病进展[31]。TGF-β1基因沉默内皮祖细胞移植可能通过降低Smad-2表达及增强Smad-7的表达从而抑制肺纤维化。TGF-β1可抑制基质金属蛋白酶(MMP)活性，加强金属蛋白酶组织抑制剂的作用，刺激成纤维细胞和巨噬细胞合成促炎和致纤维化细胞因子(TNF-α、PDGF、IL-13和 IL-1β)，参与肺纤维化形成，减少胶原分解[32]，还能够诱导AECs发生EMT和促进其凋亡，引发氧化应激反应[33]。

其余重要因子还包括：VEGF可参与血管生成和增加血管通透性，作为内皮细胞和单核细胞的趋化因子，参与内皮细胞修复，促进成纤维细胞增殖[34]，PDGF同样具有该作用。CTGF是成纤维细胞基质产生和肌成纤维细胞分化的强烈刺激因子，可诱导成纤维细胞增殖、迁移和分化，促进肺纤维化形成。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)不仅诱导单核细胞参与肺纤维化弥漫性肺泡炎的发生，其还在诱导肺纤维化中起关键作用，凝血酶可诱导其分泌增加，敲去MCP-1或其主要受体CCR2可保护BLM诱导的肺纤维化[35]。肺纤维中高表达的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)可以促进ROS的生成，通过诱导细胞发生有氧糖酵解，增加胶原的生成[36]。AngⅡ可能通过上调 Hippo信号通路中Yapl的表达和TGF-β1/smad信号通路中smad2/3的表达,从而促进Ⅰ型胶原的合成,最终诱导大鼠肺纤维化。

已有研究表明，Krebs von den lungen-6抗原(KL-6)、表面活性蛋白A(SP-A)和表面活性蛋白D(SP-D)、MMP-1和MMP-7、CC趋化因子配体18(CCL18)、IL-8、热休克蛋白70(HSP70)、CXCL-13等生物标志物可作为IPF预后指标，胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)可作为IPF诊断生物学标志物[37]。

9 展 望

肺纤维化的形成是一个极其复杂的过程，是致病因素与人体不断相互作用的结果。本文通过对肺纤维化过程中的细胞及介质进行简要阐述，以提供治疗方向及寻找早期诊断和评估疾病预后的指标。目前在理解IPF发病机制和可以提供给患者的治疗方面已经取得了一定进展。然而，关于诊断和管理的主要问题仍然存在，目前，只有来自HRCT或SLB的形态学数据可供诊断依据。对肺纤维化机制的研究已经提出了几种不同的遗传和生物标志物用于辅助诊断和预后，但是到目前为止其临床效用仍然难以明确。新鉴定的基因组学、表观基因组学和蛋白质组学生物标记物可能会彻底改变该领域，与胸部影像学和组织病理学相结合提供更好的诊断精确度。若能早期诊断肺纤维化，就能及早干预，阻止疾病进展和预防疾病发生，进而改善患者预后。