质谱技术在宫颈癌诊断中的应用及研究进展

孙克娜 综述，刘晓斐 审校

1.潍坊医学院医学检验系，山东潍坊261053；2.中国人民解放军联勤保障部队第九六医院实验诊断科，山东济南250031

宫颈癌（cervical cancer，CC）在女性生殖道恶性肿瘤中居于首位，在女性主要死亡原因中居第四位[1-2]。2018 年的调查表明我国是宫颈癌发生的高危国家[1]，面临着较重的宫颈癌诊治负担。目前宫颈癌的筛查手段主要有液基薄层细胞学检测（thinprep cytologic test，TCT）、人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA 检测、阴道镜检查和宫颈活检。临床主要应用鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）作为筛查宫颈癌的血清肿瘤标志物，它在晚期及复发的患者血清中升高明显，但在早期患者血清中无明显升高。早期诊断、及时和恰当的治疗可明显提高宫颈癌的治愈率，降低病死率。因此，急需寻找敏感而有效的早期诊断宫颈癌方法。

蛋白质组学作为一种新型的研究方法，可以动态、整体、定量观察疾病发生发展中蛋白质的种类和数量的改变，有助于研究者们寻找肿瘤早期诊断和预后的特异性标志物以及药物治疗靶标。但是，蛋白质组学作为一个完整系统，其特性和活动在很大程度上仍然难以解释。目前，先进的质谱技术让我们对蛋白质组学有了前所未有的认识，包括组成、结构、功能和调控，同时，也为复杂的生物学过程和表现提供了理论依据[3]。

1 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix- assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子。电离过程是将质子转移到生物分子或从生物分子中得到质子，而使生物分子电离的过程，离子质荷比与其飞行时间成正比[4]。它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的检测。MALDI-TOF-MS 对分析物溶液中的盐和洗涤剂有很高的耐受性[5]，可用于分析各种来源的小型有机或大型生化化合物[6]，已被证明是一种有价值的癌症诊断工具。与传统技术相比，MALDI-TOF-MS 具有准确度高、检测范围广、兼容性好等优点，可以与荧光双向电泳、磁珠等技术结合使用[7]。缺点主要是需要预处理、再现性差、信噪比和灵敏度低[8]；在检测血清样品时，受样品基质的干扰较为严重，尤其是相对分子质量低于500 的小分子多肽。

在MALDI-TOF-MS 基础上发展的可视化基质辅助激光解析吸附质谱分析成像（MALDIMSI）可将多种类型的化合物直接可视化和绘制到基质涂层组织切片上。该技术具有客观、准确、快速和所需标本量少等优点。除蛋白质和多肽外，MALDI-MSI 还可用于其他多种类型分子的研究[9]，以发现新的诊断相关生物标志物，特别是在肿瘤学研究领域[10-11]，有助于深入了解细胞癌变的机制[12]。以9-氨基吖啶为基质的MALDI 可直接检测癌组织中的蛋白质、低质量代谢物和脂质，包括乳酸、丙酮酸、琥珀酸和富马酸，其组织积累与特定综合征代谢物相关。通过蛋白质组学和代谢组学数据库中的途径信息，可以鉴定出具有与已知肿瘤生物学一致的不同代谢特征的肿瘤组织样品内的区域[11]。此外，Longuespée[13]强调基于LC-MS/MS 发现生物标记物数据的潜力，可以更好地指导MALDI 成像物质的识别。

1.1 MALDI-TOF-MS 在宫颈癌诊断中的应用

MALDI-TOF-MS 是近年来宫颈癌蛋白质组学研究最为热门的质谱技术，已取得了突破性进展。在宫颈腺癌组织中筛选出3 个低表达（抑制素、PTEN、乳铁蛋白）和4 个高表达（谷胱甘肽S-转移酶、HIPK2、CD44、半乳凝集素7）的差异蛋白质，Western 印迹结果（抑制素和PTEN 的表达变化情况）与蛋白质组学结果相一致[14]。在宫颈鳞癌组织中发现mimecan、主动脉平滑肌肌动蛋白和lumican 表达增加，而角蛋白、Ⅱ型细胞骨架5、过氧化物酶1 和14-3-3 蛋白表达水平明显降低[15]。这2 项研究分别针对宫颈腺癌和鳞癌，这些差异表达蛋白可能是宫颈癌发生的相关蛋白，可以作为宫颈癌早期诊断的潜在标志物，这也充分说明MALDI-TOF-MS 技术在癌症患者活体组织中发现异常蛋白具有实验可行性。组织学标志物研究可以为病理诊断提供分子依据，减少人为因素的干扰，能够更好地区分癌组织和癌旁组织。

1.2 MALDI-TOF-MS 在宫颈癌发生和发展机制研究中的应用

近几年，很多国内外学者热衷于信号传导通路研究领域，致力于分析宫颈癌发生和发展机制。Pappa 等[16]通过双向电泳对正常宫颈细胞（HCK1T）和HPV 阴性（C33A）、SiHa（HPV16+）、HeLa（HPV18+）宫颈癌细胞的蛋白进行分离，经MALDI-TOF-MS 筛选出113 种差异表达的蛋白质。生物信息学分析显示，肌动蛋白的细胞骨架信号通路明显失调，并且通过免疫印迹进一步验证了肌动蛋白丝切蛋白1（cofilin-1）在C33A 和HeLa 细胞中显著上调。丝切蛋白1 具有核定位信号，可以对肌动蛋白进行切断和解聚，在肌动蛋白动力学中发挥关键作用。这项研究首次发现了丝切蛋白1 与宫颈癌的发生机制有关，为宫颈癌细胞骨架信号通路的研究提供了新的思路。Kontostathi 等[17]为了研究宫颈癌细胞系分泌蛋白在癌症发生中的作用，采用同样的方法发现，转化生长因子β诱导的蛋白质ig-h3（βig-h3）和过氧化物酶2（PRDX2）在宫颈癌细胞系中的表达显著增加。这项研究与之前Monge 等[18]报道的转化生长因子β与子宫癌发生和发展有关的研究结果相一致。Kontostathi 等进一步采用生物信息学方法，发现宫颈癌细胞系中转录因子NRF2 是表达差异蛋白的调节因子。为了验证这一生物信息学预测，采用免疫印迹和多重反应监测（MRM）方法检测了NRF2 的表达水平，发现与HCK1T 相比，NRF2 在SiHa 和C33A 细胞中表达上调。需要指出的是，异常的NRF2 介导的氧化应激反应（OSR）是癌症发生的一个显著特征[19]。作为一种重要的转录调节因子，NRF2 可以保护人体细胞免受氧化损伤，但NRF2 介导的氧化反应也是调节宫颈癌细胞系分泌蛋白的重要途径。该实验为后续开展宫颈癌研究提供了新途径，致力于发现该途径蛋白质之间的相互作用，将为理想标志物的筛选和机制研究提供理论基础。

1.3 MALDI-TOF-MS 在宫颈癌治疗研究中的应用

最近，在HeLa 和侵袭性HeLa-15 细胞中发现孕酮受体膜组分1（PGRMC1）能够调控宫颈癌细胞的进展和转移，是宫颈癌潜在的治疗靶点[20]。Chen 等[21]在手术预后研究中发现，转酮酶（TKT）和纤维蛋白原α链前体（FGA）是评估CC 患者手术预后的血清标志物。迄今，在宫颈癌治疗过程中能够用于临床的标志物非常少，因此临床应用价值还须进一步探讨。宫颈鳞癌新辅助化疗（NAC）在缩小肿瘤、控制微转移、减少阳性淋巴结的数量和选择手术方面具有重要意义。但是，在治疗过程中，宫颈癌患者对大部分化学治疗剂具有抵抗性，降低了该疗法的有效性。Guo 等[22]为了寻找SCC 患者对NAC 反应的预测标志物，采用二维凝胶电泳对接受NAC 的宫颈鳞癌患者的癌灶蛋白进行分离，将差异表达的12 个蛋白点通过MALDI-TOF 进行检测。NAC 无应答者与NAC响应者相比，7 个蛋白质点上调，5 个蛋白质点下调。这些蛋白质参与细胞代谢、迁移和凋亡信号转导等多种细胞过程。最后，通过免疫印迹鉴定了3 个蛋白，驿蛋白1（stathmin1）、Hsp70 和丙酮酸激酶同种型M2，并且发现Hsp70 的过表达有抑制顺铂的效果。该研究发现了许多候选蛋白质参与化疗耐药/敏感性的调控，其中Hsp70 可能是预测宫颈鳞癌患者化疗疗效的潜在标志物。

2 表面增强激光解吸电离飞行时间质谱

2002 年，田中耕一发明了表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS），由蛋白质芯片、激光吸收离子化质谱设备和人工智能数据分析处理软件三部分组成，其检测原理是利用激光脉冲辐射使芯片表面结合能量，吸收分子的分析物，解析成带电离子，质荷比不同的离子在磁场中飞行时间不同，经计算机软件处理后形成模拟图谱。质谱图和离子流图相结合可直观显示获得的蛋白质的相对分子质量、含量、等电点、磷酸化位点、糖基化位点等信息。SELDI-TOF-MS 应用简便，高通量，自动化，能够不经处理直接点样检测标本中的多种蛋白质。但它对高分子量蛋白质不敏感，仅限于对低分子量肽的分析[23]。随着标准检测条件和蛋白资料库的不断完善，再结合基因组积累的大量信息，相信SELDI-TOF-MS 必将成为临床常规诊断和基础理论研究的重要技术手段。

2.1 SELDI-TOF-MS 在宫颈癌诊断中的应用

近年来，随着蛋白质组学研究的不断深入，运用SELDI-TOF-MS 技术检测宫颈癌患者的特异多肽标志物，为宫颈癌的诊断、治疗效果及预后复发的评估提供了新的思路。梁卫江等[24]采用SELDI-TOF-MS 研究宫颈鳞癌患者血清差异蛋白质与SCCA 之间的关系，发现m/z4172、3397、2741和6086 在宫颈鳞癌SCCA 正常组和升高不同水平组中反复出现，这些蛋白质可作为宫颈癌早期标志物进行深入研究，具有重要的临床应用前景和研究价值。SELDI-TOF-MS 样品来源广泛，血液、尿液和组织液等均可作为检测对象。在血清标本中，蔡思娜等[25]采用SELDI-TOF-MS 结合弱阳离子磁珠检测了25 例健康女性志愿者和24 例SCCA 正常的宫颈癌患者血清，筛选出4 个显著性差异的多肽峰。通过建立联合诊断数据模型进行分析，发现其诊断宫颈癌的敏感性和特异性分别为91.67%、96%，达到了比较理想的结果。在尿液标本中，Mu 等[23]通过SELDI-TOF-MS 对比经木菠萝甘露糖结合（champedak mannose binding，CMB）凝集素捕获宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌和健康者的尿糖肽，发现m/z1201 能将卵巢癌与宫颈癌和子宫内膜癌区别开来，敏感性和特异性均为100%，而m/z1449 能将子宫内膜癌与其他2 种癌症区分开。尿糖肽m/z1201 和1449 可作为早期诊断宫颈癌、卵巢癌和子宫内膜癌的潜在生物标志物。这些研究证明了SELDI-TOF-MS 在临床诊断方面的优势及其可行性。但目前大多数研究标本量较少，需要增加标本量做进一步的验证。

2.2 SELDI-TOF-MS 在宫颈癌治疗研究中的应用

在宫颈癌治疗过程中通过SELDI-TOF-MS 分析，证实SCCA 可以用来判断临床分期和指导临床手术[26]。SCCA 的临床应用不再局限于筛选宫颈癌患者和评估化疗疗效，可以有效地避免TCT和病理诊断取材的限制，月经经期也可以进行检测，减少了诊断时间，提高了患者的生存周期。另外，Van 发现m/z2698.9、3953.2 和15254.8 与淋巴结转移有关[27]。放化疗是治疗晚期宫颈癌的一个主要手段，在评估治疗效果的研究中，Harima等[28]通过SELDI-TOF-MS 对评估良好的宫颈癌患者和已死亡宫颈癌患者的2 组血清与健康体检者的血清分别进行比较，筛选出m/z8918（已死亡患者明显低于对照组和评估良好的患者），然后采用肽质量指纹图谱和串联质谱方法鉴定出与该肽峰最匹配的蛋白是载脂蛋白CⅡ（ApoC-Ⅱ），并通过ELISA 进一步验证和确认。众所周知，基质金属蛋白酶（MMP）是肿瘤侵袭和转移的关键介质，参与细胞增殖、分化、血管生成和细胞迁移。ApoC-Ⅱ作为MMP 的新型底物，对宫颈癌进展的调控具有重要作用。

3 结语

虽然SELDI-TOF-MS 和MALDI-TOF-MS 功能强大，可用于筛选新型生物标志物，但也面临着一系列的难题。例如，质谱仪价格昂贵，对操作人员的要求高，使该项技术很难在基层开展。最重要的问题是，要简化蛋白质质谱联用技术检测的步骤，满足高通量蛋白质组学研究的需要。另外，目前肿瘤标志物的研究样本量较少，不能对各个年龄、各个民族进行充分验证，还需要深入研究。蛋白质图谱揭示了基因所编码的蛋白质的表达、蛋白质的修饰以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用。随着质谱技术和生物信息学的不断发展，我们可以对尿液、血清、组织等多种类型标本的蛋白质组学进行分析，获得更多的生物学信息。我们还可以通过生物信息学技术不断完善蛋白质组数据库，进而分析癌症患者发生癌变的机制和关键步骤，探索出有针对性的预防和治疗方案，为疾病的早期诊断和预后判断提供有效的手段。