钙离子在镉诱导的肾毒性中的作用机理

任 真, 赵金凤, 张 瑶, 谢益敏, 周 阳, 顾 杰*, 施海峰*

1.江苏大学生命科学研究院, 江苏 镇江 212013;2.江苏大学附属宜兴医院, 江苏 宜兴 214200

镉是一种有毒重金属，可长期富集在生物体中，对生物体造成巨大危害。在人体中的生物半衰期可长达10～30年[1]。镉通过食物、空气、水等途径被人体摄入后会累积于肾脏、肝脏、脾脏和胰腺等器官[2,3]；诱导包括肾脏[4]、肝脏[5]、神经元[6]和胸腺[7]等多种器官和组织的凋亡；导致肾脏受损，并导致肺、心血管和肌肉骨骼系统的功能异常[8]。肾脏是镉暴露和毒性的主要靶器官[9,10]。长期镉暴露后约50%的镉会累积于肾脏中，并且大部分蓄积于肾近端小管上皮细胞，引发肾脏受损，甚至增加癌症发生的几率[11,12]。

细胞内钙稳态对维持细胞内许多生物过程十分重要[9,10,12]。镉能够破坏细胞内钙离子稳态，并导致包括肾脏细胞[13,14]在内的多种细胞凋亡[11,15～18]。内质网是细胞中最大的储存钙离子的细胞器，也称为“钙库”[19]。镉暴露会减少细胞外钙离子流入[20,21]，或促进细胞内“钙库”的钙离子释放[13]，导致胞内钙离子稳态失衡。本文就镉对肾脏细胞内钙离子浓度、钙离子信号通路和钙稳态的影响和机理，以及目前可通过调节钙离子动态平衡减轻镉的肾毒性的药物进行综述，以期为相关研究提供参考。

1 镉对细胞钙离子浓度的影响

胞浆中钙离子浓度的升高是由于胞外介质中钙离子流入胞内增加，或钙库的钙离子释放到胞浆增多[18]。虽然细胞内钙离子浓度的上升是所有类型细胞中的关键信号，可调控许多细胞过程，如基因转录、胞吐作用等[22]；但细胞内钙离子浓度不受控制的升高通常具有细胞毒性[17]。

镉暴露会破坏细胞中钙离子的动态平衡，诱导细胞凋亡。在大鼠心肌细胞中，镉诱导内质网钙离子释放，引发内质网应激，导致胞浆钙离子浓度的上升，最终引起细胞凋亡[11,18]。小鼠肾小球系膜细胞MES-13中，镉诱导的细胞凋亡也是由钙离子信号通路介导的[2]。亚细胞钙的重新分布在重金属暴露诱导细胞内质网应激中可能扮演着重要的病理介质的角色。镉还会引起细胞中钙离子在不同细胞器间的重新分布。在大鼠肾近端小管细胞中，镉暴露后内质网钙离子浓度下降，而线粒体钙离子浓度升高[14]，在Wistar大鼠肝脏细胞[23]和肾脏细胞HEK293[24]中，镉暴露后出现胞浆钙离子浓度升高、内质网钙离子浓度下降的现象。本实验室在小鼠肾小管上皮细胞中也证实镉能够诱导内质网钙离子的流失，胞浆中钙离子浓度上升引起细胞凋亡[25]。为弥补胞内钙库中钙离子的大量流失，细胞会从胞外环境中吸收钙离子，然而这反而进一步加剧了胞内钙离子的稳态失衡[13]。可见，镉通过扰乱胞浆和细胞器中的钙离子流动破坏了肾脏细胞内钙离子的动态平衡。

2 镉对钙离子转运相关蛋白的影响

2.1 镉对细胞膜上钙离子转运相关蛋白的影响

镉通过调节细胞膜上的钙离子吸收蛋白和输出蛋白，导致细胞内钙离子浓度异常。由于镉对La3+而不是L型钙离子通道敏感，因此镉诱导钙离子流入胞内的过程可能是由非选择性钙离子通道介导的[26,27]。Yeh等[13]发现镉通过非选择性钙离子通道将钙离子引入，诱导Madin Darby犬肾细胞引起胞浆钙离子浓度升高。

钙离子ATP酶(plasma membrane Ca2+-ATPase，PMCA)属P型ATPase家族。磷酸化后出现E1和E2两种构象，E2构象与钙离子亲和力小于E1构象。PMCA通过两种构象的交替存在实现了钙离子的转运[28]。钙酶活力的下降会导致钙离子不能正常被转运到细胞外，导致胞浆中钙离子累积。肾细胞中PMCA是主要的钙离子输出蛋白。镉介导的PMCA活性损伤对组织功能的影响是双重的。首先，通过抑制PCMA, 镉阻止其自身的排出，导致其在细胞内逐渐积累，并触发其本身的促凋亡信号通路。其次，PMCA的抑制作用导致细胞质钙离子浓度的增加，通过凋亡甚至坏死导致细胞死亡[29]。由此，镉通过破坏肾脏细胞对胞外介质中钙离子正常的吸收和输出，促进胞内钙离子浓度异常升高。

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C (phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC)的激活对胞浆钙离子水平的升高起着关键作用。该酶催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸水解产生三磷酸肌醇(inositol trisphosphate, IP3)和二酰甘油[30]。三磷酸肌醇与其内质网上的受体结合，触发钙离子释放到细胞质中，而二酰甘油参与蛋白激酶C的激活[30,31]。镉可通过二价阳离子受体(cation-sensing receptor, CSR)介导的磷脂酶C-三磷酸肌醇(PLC-IP3)信号通路诱导内质网钙离子释放，引发内质网应激[15,32]。此外，大量研究表明，镉调节许多Ca2+依赖性调节蛋白的功能，如蛋白激酶C、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、钙调蛋白和钙/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶Ⅱ，诱导细胞内钙离子稳态失调[33～40]。这些细胞内钙调蛋白均可由负责调控体液中钙稳态的G蛋白偶联受体-钙敏感受体(calcium sensing receptor, CaSR)介导[41]。早前Faurskov等[42]发现CaSR激动剂新霉素减少了非洲爪蟾肾远端小管上皮细胞A6中镉诱导的细胞内钙离子增加。本实验室的研究结果证实激活CaSR可降低镉诱导的胞浆中上升的钙离子浓度，修复镉破坏的细胞内钙离子动态平衡，减轻镉诱导的肾细胞毒性[25]。这表明镉激活的信号通路和钙离子自身的信号通路对胞内钙离子的动态平衡可能存在竞争调节作用。

2.2 镉对内质网钙稳态相关蛋白的影响

内质网具有两个钙离子释放通道：三磷酸肌醇受体(inositol trisphosphate receptor, IP3R)和鱼尼丁受体(ryanodine receptor, RyR)，还有一个钙离子回流通道：肌浆网Ca2+-ATP酶(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)，这3个钙离子通道间的平衡对维持内质网钙离子动态平衡至关重要[43]。IP3R主要位于内质网上，是第二信使三磷酸肌醇(IP3)跨膜转导体系的重要成员。IP3R有3种亚型(IP3R1、IP3R2和IP3R3)，以同源四聚体形式存在，胞浆内游离的Ca2+能触发IP3R通道开放，释放内质网贮存的钙离子，使[Ca2+]i升高[44]。在肾小管近端上皮细胞中，内质网膜上的钙离子释放通道主要是IP3R[45,46]。镉处理后的肾近端小管细胞，IP3及其内质网上的受体IP3R-1和IP3R-2的蛋白质水平显著增加，IP3激活IP3R后促进内质网钙离子的释放[14]。

SERCA是一种广泛存在于动植物细胞中的能够将钙离子从细胞质转运到内质网中的泵[47]。SERCA包括3个亚型(SERCA1、SERCA2和SERCA3)，SERCA2包括SERCA2a和SERCA2b两个亚型，其中SERCA2a在心肌钙调控中受到广泛关注。当[Ca2+]i升高并超过阈值(10 mol/L)时，SERCA可将胞浆中的钙离子重新摄取到内质网中，使心肌细胞舒张，同时为下一次心肌收缩储备钙离子[28]。通过对钙离子的这种转运，SERCA起到了维护钙离子稳态的作用[48]。SERCA2b则在各种组织器官中都有表达，起到将钙离子输送回内质网的功能，维护了钙离子稳态[49]。在肾脏中，镉暴露导致SERCA活性降低，抑制胞浆中的钙离子回流进入内质网钙库，导致内质网钙离子稳态失衡[50]。SERCA介导钙离子透过内质网膜的速率通过受磷蛋白(phospholamban, PLB)来控制。当PLB与其结合时，SERCA活性降低，钙离子转运的速率降低。磷酸化PLB可减少SERCA和PLB的结合，当SERCA与PLB解离后，钙离子转运增加[51]。因此，镉也可能通过影响SERCA和PLB的结合，抑制钙离子的转运。镉对内质网钙稳态相关蛋白的影响说明镉对内质网钙稳态具有双重毒性，既能够持续促进内质网钙库中钙离子释放进入胞浆，又能抑制胞浆中的钙离子回流进入内质网钙库，加剧内质网和胞浆钙离子稳态失衡。

3 缓解镉毒性的方法和药物

镉不仅蓄积在肾脏中导致肾功能受损，还会在其他如肝脏、骨骼等组织器官中累积并造成组织损伤或代谢紊乱。镉暴露后小鼠肝脏会发生体积肿大、肝叶肿胀、颜色变黑等病理学变化[52]。同时，镉还会引起骨骼毒性导致骨质疏松[53]。近年来，有许多研究致力于寻找减轻甚至完全逆转镉毒性的方法和药物，主要是通过缓解镉暴露诱导的氧化应激和细胞内钙离子稳态失衡等途径。

3.1 通过缓解镉引起的氧化应激缓解镉毒性

镉暴露后可导致组织和细胞产生氧化应激造成组织损伤和细胞凋亡，而减轻氧化应激可减轻镉的毒性。周庆彪等[54]发现硒能有效拮抗慢性镉暴露导致的大鼠肾脏毒性，其作用机制可能是氧化应激条件下，硒通过抑制SETD6促进DJ-1蛋白的表达，进而促进抗氧化转录因子Nrf2表达，增强机体抗氧化能力，减轻镉暴露诱导的氧化应激损伤。硫化锌(ZnSO4)对镉毒性也具有拮抗作用，锌可诱导体内锌金属硫蛋白(ZnMT)合成，ZnMT可通过增加抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质过氧化等途径对镉致肝肾损伤起到拮抗作用[55]。有研究表明金属硫蛋白(metallothionein，MT)除了在金属代谢、储存及解毒等方面有重要作用外，还是体内清除自由基能力很强的一种蛋白质[56]。MT可通过拮抗氧化应激减弱镉对骨的损伤[57]。甘草酸二铵是甘草的主要成分，甘草次酸的衍生物，具有抗氧自由基作用。可通过提高被镉抑制的抗氧化酶的活性而对肝脏起防护作用，提高机体抗氧化能力，清除体内自由基，减少自由基对组织和细胞的损害[58]。

3.2 通过调节钙离子稳态缓解镉肾毒性

镉暴露可导致组织和细胞中钙稳态失衡而造成的组织损伤和细胞凋亡，而通过调节细胞中钙离子水平可减轻镉的毒性。BAPTA-AM作为一种胞内游离钙离子螯合剂，可显著降低镉诱导的胞浆中钙离子浓度的上升，减轻镉诱导大鼠肾近端小管细胞的凋亡[14]。2-APB是内质网释放钙离子通道IP3R的一种阻断剂，可抑制镉诱导大鼠肾近端小管细胞胞浆和线粒体内钙离子浓度的升高[14]。槲皮素作为一种广泛存在的膳食抗氧化剂，具有预防镉诱导的大鼠肾小管细胞毒性的作用，且可以显著抑制镉诱导的胞浆钙离子浓度的上升[59]。本实验室研究结果表明拟钙剂NPS R-467作为钙敏感受体CaSR的激动剂，既可以维持小鼠肾小管细胞内钙离子的动态平衡，减轻镉引起的肾小管细胞毒性，还能增加镉抑制的肾小管细胞的增殖[25]。虽然直接抑制钙离子释放和螯合超载的钙离子可以减轻镉诱导的肾脏毒性，但是并不能彻底修复镉破坏的肾小管细胞内钙离子的动态平衡、肾脏细胞对胞外介质中钙离子的吸收与释放，以及内质网钙库正常生理水平的钙离子输出和回流。而通过调控可动态调节钙离子动态平衡的作用靶点，或可更有效地维持和改善细胞内外的钙离子动态平衡，以防治重金属等诱导的肾脏受损，并减少副作用。

3.3 其他方式缓解镉毒性

除上述两个缓解镉毒性的途径外，其他方法也在不断研究中。Boyce等[60]在筛选细胞免受内质网应激的小分子时发现，Salubrinal可抑制真核翻译起始因子2亚基α (eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)的去磷酸化，从而保护非洲绿猴肾细胞Vero免受内质网应激诱导的细胞凋亡。Komoike等[61]的研究结果表明，Salubrinal可抑制内质网应激，并通过抑制细胞死亡信号通路减少镉诱导的人肾小管上皮细胞HK-2凋亡。王林等[62]的研究结果表明，葛根素puerarin可通过恢复自噬、阻断溶酶体膜透化作用、抑制Nrf2通路，减轻镉诱导的大鼠肾小管细胞的细胞毒性。早前，Liu等[63]在大鼠肾小管细胞中的研究表明，镉通过抑制钙依赖型的自噬体-溶酶体融合破坏自噬流。本实验室的研究证明，钙离子介导了镉破坏的小鼠肾小管细胞的自噬，这加剧了细胞凋亡；而拟钙剂NPS R-467激活钙敏感受体CaSR后，恢复了胞内钙离子的动态平衡和自噬，对减轻镉引起的肾小管细胞毒性也发挥了作用[25]。

镉会破坏细胞内的多种途径，如活性氧和ROS途径[64]、细胞自噬途径[65]、未折叠蛋白质应答反应(UPR)途径[66]、线粒体介导的Caspase依赖性和非Caspase依赖性途径[67]等。这些途径与钙离子稳态及钙离子信号具有紧密的联系。维持好钙离子动态平衡或可阻滞镉诱导的这些途径，对减轻镉诱导的肾毒性具有一定的保护作用。

4 展望

镉是一种环境污染物，镉暴露与肾脏疾病[68]、骨质疏松症和骨折[69]、动脉粥样硬化[70]和心血管疾病有关[71]。镉进入人体后主要积聚于肾脏。在肾脏中，镉主要贮存在肾小管细胞中，引发肾脏受损，加之致癌特性，在一定条件下会导致肾小管上皮细胞癌变[72]。

镉引起肾小管上皮细胞的钙离子稳态失衡：一方面，镉通过调节肾细胞膜上的钙离子转运通道，增加钙离子流入，阻止钙离子流出，导致胞内钙离子浓度剧增。另一方面，镉激活PLC-IP3信号通路促进内质网钙离子通过流出通道IP3R流入胞浆；同时，镉抑制SERCA阻止胞浆中的钙离子回流入内质网钙库。由此加剧内质网应激，进而导致细胞死亡。针对该过程，早前在细胞实验中，使用一些钙离子信号通路抑制剂和螯合剂可减轻镉诱导的肾毒性。目前，通过调控可动态调节钙离子动态平衡的作用靶点，而不是简单的抑制和螯合，或可更有效地防治重金属等诱导的肾脏受损，并减少副作用，其作用机理仍在深入发掘中。这些研究为镉和其他重金属或其他应激所引发的毒性机制相关研究与人类健康的后续研究奠定了基础并提供了新方向。