雌激素受体作为壬基酚的主要作用靶点导致机体免疫毒性

傅相均，许洁，蒋智钢，俞捷

遵义医科大学公共卫生学院，遵义563099

免疫系统与神经和内分泌系统的联系十分紧密，3个系统之间相互影响，共同组成神经内分泌免疫网络[1]。雌激素作为一种重要的性类固醇激素，通过直接调节免疫器官、免疫细胞等的发育以及免疫相关因子的分泌[2]，对自身免疫病如败血症的发生和发展有重要的作用。雌激素对机体生理活动的调节主要通过与雌激素受体结合实现信号的传导。传统的雌激素受体如ERα广泛分布于免疫器官细胞中，能够与雌激素或类雌激素化合物结合，从而引发基因调控机制[3]，调节下游与自噬、内皮功能、代谢以及血管再生等生理过程相关的基因转录表达。雌激素除了与传统的雌激素受体(estrogen receptor, ER)结合外，近年来发现雌激素还能与G蛋白偶联受体30/G蛋白雌激素受体1(GPER1)结合经由非基因组机制介导细胞内相关快速调节反应。与传统的细胞内雌激素受体不同，GPER1属G蛋白偶联受体家族[4]，是有7个跨膜结构域的细胞膜蛋白，虽然雌激素与GPER1的结合力是与传统雌激素受体结合力的1/10，但是GPER在多种免疫细胞如巨噬细胞中均有表达[5]，雌激素与GPER1结合会产生如下影响：(1)降低细胞炎性反应，调节相关免疫因子的产生；(2)同时降低LPS引起的巨噬细胞TNF-α分泌，引起TLR4的表达降低从而抑制巨噬细胞的功能；(3)抑制NF-κB信号通路[4]，并且GPER1与传统雌激素受体存在协同作用，共同调节细胞内钙离子流、cAMP的合成以及PI3K的活性，调节机体的免疫反应[6]。

壬基酚(nonylphenol, NP)作为配体作用于雌激素受体和芳香烃受体影响机体内分泌系统已有比较广泛的研究，而NP对免疫系统的干扰作用研究相对较少[7]。NP广泛用于表面活性剂、抗氧化剂、纺织印染助剂、润滑油添加剂、农药乳化剂、树脂改性剂、树脂及橡胶稳定剂等领域[8]。研究发现，相对于抗原驱动的免疫反应或适应性免疫反应，NP对免疫系统的影响较为复杂[9-10]，可同时产生免疫激活和免疫抑制效应，破坏先天免疫平衡。目前研究所知的NP对免疫系统的干扰作用主要体现在对免疫细胞尤其是T细胞的影响[11]。CD4+T淋巴细胞包括Th1和Th17辅助T细胞，产生促炎细胞因子，而Th2或Treg细胞，产生抗炎或调节细胞因子[12]。低水平雌激素与Th1 T细胞的发育相关，在怀孕期间高水平雌激素[13]，能够促进Th2极化，因此，NP竞争性地与雌激素受体结合会干扰机体正常的免疫功能。研究表明，NP会引起CD4+极化，破坏Th1与Th2之间功能的平衡，引起免疫失调，但是具体哪一方占据优势取决于NP浓度及其暴露时间[14]。除了与雌激素受体结合外，NP能够与芳香烃受体结合并调节其活性[15]，而芳香烃受体活性与雌激素的合成代谢密切相关[16]；并且NP还能拮抗与炎性相关的过氧化物酶体增殖激活核受体(PPAR)的活性[17]，使其介导的PPAR依赖性抗炎反应失调[18]。最新研究发现，孕鼠NP暴露会增加子代鼠肝脏炎性因子TNF-α、IL-10β的生成并导致肝脏组织形态和功能异常[19]。本综述将主要阐述近年来NP对免疫系统的干扰，总结其造成免疫毒性可能的分子机制[20]。

1 NP对免疫系统的影响及机制(The effect of NP on the immune system and its mechanism)

1.1 NP对免疫器官的影响(Effect of NP on immune organs)

脾脏作为外周免疫器官的核心，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是体内产生抗体的主要基地[21]，对体液免疫和细胞免疫功能的完整发挥至关重要的作用[22]。研究发现，NP暴露会导致脾脏体积缩小，质量下降，高剂量NP暴露导致大鼠脾脏白髓减少、脾脏组织减少、脾脏体积缩小[23]；体外细胞实验发现NP暴露导致脾脏细胞的生长周期被阻滞，脾脏细胞的生长发育受到阻碍[24]，脾淋巴细胞内Ca+水平和ROS水平明显升高[25]，脾脏细胞内线粒体膜电位明显降低，脾脏淋巴细胞凋亡率明显升高[7]，由此可知，NP会导致脾脏损伤以及脾脏细胞功能紊乱，从而对外周免疫系统造成损伤[26]。

胸腺作为中枢淋巴器官，是与免疫功能有关的最大腺体，其分化和发育受多种内分泌激素尤其是雌激素的调控[27]。研究发现，NP暴露能够引起胸腺脏器指数的明显降低，并且使得胸腺组织和淋巴细胞发生损伤，淋巴细胞内ROS水平明显升高[28]，淋巴细胞凋亡率水平同样升高；病理生理学检查发现，中高剂量NP暴露会导致小鼠胸腺皮质变薄[28-29]。由此可知，NP可通过对胸腺及脾脏造成损伤，阻碍免疫器官的发育，破坏机体免疫屏障，从而产生免疫毒性，导致免疫系统的紊乱[29]。

1.2 NP对免疫细胞的影响(Effect of NP on immune cells)

众所周知，机体的特异性免疫应答主要由T细胞执行，随着年龄的增大，体内雌激素水平也随之增加，胸腺上皮细胞上的雌激素受体处于持续激活状态，抑制T细胞增殖和分化[9]，有研究发现，NP能够直接抑制T淋巴细胞的增殖和生长[30]。其机制主要是体内蓄积的NP通过与胸腺上皮细胞上的雌激素受体竞争性结合，引起胸腺上皮细胞ER受体合成升高，同时促胸腺增殖的胸腺素分泌减少，导致胸腺组织萎缩，抑制T细胞增殖和分化[10-30]。另外，T淋巴细胞随着时间的延长会出现凋亡，T淋巴细胞的凋亡主要由Fas/FasL信号通路调节。Fas及其配体FasL是近年来研究得最为深入的有关细胞凋亡的膜表面分子，FasL是能够结合到死亡受体TNFRSF6/FAS的细胞因子，在T细胞发育中介导由细胞毒性引起的凋亡。研究发现，NP能够激活Fas/FasL信号通路，从而加快T淋巴细胞的凋亡[31]。

机体的非特异性免疫应答主要由B细胞执行，雌激素通过诱导基质细胞产生一些抑制物质，改变骨髓的微环境，而骨髓微环境的稳定又是细胞前体存活和增殖的关键。研究表明，雌激素作为淋巴细胞生成的调节剂，其水平增加导致B淋巴细胞减少，水平降低引起骨髓中B淋巴细胞合成水平上调；研究发现，具有拟雌激素特性的NP通过引起骨髓微环境的改变，抑制B淋巴细胞的分化和成熟。因此，NP通过影响免疫细胞(T细胞和B细胞)的分化成熟以及凋亡，干扰机体执行正常的免疫应答功能[22-24]。

1.3 NP对免疫因子的影响(Effect of NP on immune factor)

近年来，已有研究报道了NP可以通过调节免疫因子的合成对免疫系统产生影响[32]。自身免疫系统疾病通常是由促炎因子与抑炎因子在细胞内表达水平失调催发的[22-24]，这2类免疫因子分别是由2种辅助型T细胞即Th1和Th2分泌，机体正常免疫功能的发挥依赖于Th1和Th2正常的细胞功能以及两者功能活性间的动态平衡。Th1细胞介导细胞免疫应答，主要分泌IL-2、IFN-γ和INF-α等促炎因子，在抗感染以及排斥反应中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-6等抑炎因子，介导体液免疫应答，辅助B细胞抗体生成，下调抗原呈递细胞及Th1细胞的活性，起免疫抑制作用，因此Th1/Th2细胞功能失衡，会引起免疫系统瘫痪[33]。研究发现，NP能够有效抑制Th1细胞发育并导致其IFN-γ等细胞因子分泌水平降低；相反，NP促进Th2细胞发育，诱使其分泌的IL-4/IL-6水平升高[34]，从而引起2种辅助型T细胞功能失衡，破坏细胞正常的免疫应答反应。因此，NP的免疫毒性除了体现在对免疫器官、免疫细胞发育的抑制作用外，还表现为干扰免疫因子的合成分泌(主要表现为抑制促炎因子细胞因子的表达，抑制抑炎因子的分泌)，间接对特异性免疫应答产生抑制作用[35]，造成免疫紊乱。

1.4 雌激素受体依赖免疫毒性(Estrogen receptor-dependent immunotoxicity)

多种免疫相关因子的分泌与核受体的调节相关，与配体结合或磷酸化后的雌激素受体形成同源或异源二聚体[36]，转移到细胞核内，直接与雌激素反应元素结合或通过与活化蛋白1(AP-1)结合介导免疫相关基因的表达[37]。研究发现，NP暴露导致小鼠IL-4分泌水平明显升高，同时调节IL-4合成分泌的转录因子NF-AT的活性增强[36]。AP-1参与调节NF-AT转录因子与对应基因位点结合，介导IL-4相关基因的转录翻译[20,35]。因此，调节NP可能通过以下2种机制影响ER-α及其下游活性：(1)作为配体进入细胞内与雌激素竞争性结合雌激素受体，使其激活后形成二聚体入核，与AP-1结合激活NF-AT转录因子入核，促进免疫因子IL-4表达[38]。(2)与细胞膜上的雌激素受体GPER1结合，激活PI3K/AKT通路，激活PI3K/AKT通路，引起雌激素受体磷酸化激活入核调节IL-4基因表达或激活NF-ΚB炎性反应信号通路，干扰机体正常的免疫反应，产生免疫毒性[39]。

1.5 非雌激素受体依赖免疫毒性(Non-estrogen receptor-dependent immunotoxicity)

研究表明，NP暴露导致COX-2表达活性明显升高，细胞ROS水平上升[40]，免疫细胞包括淋巴细胞凋亡率升高，而介导氧化反应的COX-2表达由AKT/MAPK/CRE信号通路介导[41]，因此，NP可能作用于多种膜蛋白受体(G蛋白偶联受体、酪氨酸酶受体和整合素受体)，激活AKT/MAPK信号通路，引起免疫细胞ROS水平异常，细胞凋亡率增加。NP与脂质代谢相关的蛋白CD36、PPARγ相互作用，引起体内脂质代谢的异常[42]，进而引起细胞如内质网应激等异常反应，激活Ca2+通道引起细胞内Ca2+浓度升高，促进免疫因子合成相关的转录因子如NF-AT激活入核，导致相关免疫因子分泌异常，造成免疫毒性[33]。

1.6 通过与其他信号通路耦合作用产生免疫毒性(Immunotoxicity by coupling with other signaling pathways)

细胞内多种经典通路如mTOR、PI3K/AKT、IGF-1、TGF-β和STAT/JNK等通路与免疫系统密切相关，并且这些信号通路之间存在错综复杂的联系，牵一发而动全身。比如PI3K/AKT介导NF-κB的核转位、免疫因子的表达、免疫细胞的分化和炎性小体的降解等，而insulin、IGF等信号通路又能调节AKT信号通路的活性[43]。并且NP暴露引起免疫因子IL-6表达水平的升高，而IL-6与这些通路存在互相调控的耦合作用，如IL-6通过作用于STAT/JNK或PI3K/AKT通路调节免疫细胞的成熟分化[41-42]，可干扰细胞正常的免疫应答，产生免疫毒性。除了通过IL-6，有研究表明，NP可以直接作用于PI3K/AKT、IGF-1等信号通路，对免疫系统产生干扰作用[44]。因此，NP产生的免疫干扰作用不同于抗原引起的免疫应答，它既可以进入细胞内调节核受体的活性，也可以与膜蛋白直接结合，通过不同的信号通路影响细胞正常的生理活性，导致免疫毒性[30]

2 结语(Conclusion)

NP作为典型的环境内分泌干扰素，其对免疫系统的影响逐渐引起重视，但是主要机制局限于NP通过拟雌激素作用竞争性结合雌激素受体，对机体造成免疫毒性，其具体机制以及除雌激素信号通路的干扰作用外的其他相关机制研究甚少。本综述结合近年来相关动物及细胞分子实验结果，总结NP免疫干扰的新机制，作为今后研究NP对细胞膜表面受体的调节作用及其与免疫毒性的关系的重要参考。