树鼩在生物医学研究中的优势与挑战

贾 杰， 代解杰

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所，实验树鼩标准化与应用研究省创新团队，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室， 昆明 650118)

1 背景

树鼩(Tupaia Belangeris， tree shrew)是一种形似松鼠、吻部较长的小型哺乳动物， 分类学上是介于灵长目与食虫目之间的攀鼩目，主要分布于南亚、东南亚及我国南部如云南、贵州、广西、广东、海南等地区，全世界现生的树鼩有12个种50个亚种，中国有1个种6个亚种，全世界学者用于生命科学研究最为广泛的是中国的滇西亚种树鼩(Tupaia Belangeris Chinensis)。树鼩全基因组有93.4%与灵长类动物相似，其组织解剖结构、生理生化和免疫学等生物学特性近似于人类，在生物医学研究领域中有很大的应用潜力[1]，世界卫生组织(WHO)在1990年代就建议用树鼩代替大型灵长类动物进行科学实验。由于树鼩在进化上的优势和自身的生物学特性，目前检索数据库中应用树鼩开展实验动物标准化、质量控制及标准、病原体检测方法建立、人类疾病动物模型创建及疾病机制等方面研究的文献报道已有近3 000篇。在国家“十一五和十二五”科技支撑计划项目和云南省科技计划项目的支持下，中国医学科学院医学生物学研究所攻克了树鼩人工饲养繁殖、实验动物标准化和封闭群树鼩种质资源基地建设等关键技术，将滇西亚种树鼩研发为具有我国自主知识产权的实验动物新品种，并在人类疾病树鼩模型研究中取得了长足的进步。本文就树鼩在病毒性肝炎、视觉疾病、肿瘤、神经系统疾病和代谢性疾病等方面的研究，探讨树鼩在生物医学研究中的优势与面临的问题。

2 病毒性肝炎

除了人类和黑猩猩外， 树鼩是唯一可以被乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染的动物。Yan等[2]研究表明， 在树鼩体内牛磺胆酸钠协同转运多肽是人HBV的功能性受体。慢性乙型肝炎e抗原(HBeAg)的血清学转换与白细胞介素-21(IL-21)密切相关，树鼩的IL-21 基因序列比啮齿类更接近人类， 基因序列同源性高达83.33%，树鼩IL-21的二级结构、疏水性及表面电荷分布与人IL-21相似，树鼩IL-21可以通过抗人IL-21抗体检测， 重组人IL-21可诱导树鼩脾淋巴细胞的 IL-10 和γ干扰素(IFN-γ）的高表达， 说明树鼩 IL-21 与人 IL-21 之间具有免疫交叉反应性[3]。IL-21与肝纤维化的发病机制、肝衰竭和肝细胞癌相关，树鼩IL-21与人IL-21的相似性使得其在肝炎病毒感染机制研究中具有独特优势。此外，胞嘧啶脱氨酶(Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3 proteins， APOBEC3)家族是一系列抗病毒因子，可抑制HBV复制。树鼩APOBEC3基因座结构、表达模式及其功能可能与人类相似[4]。Ruan等[5]研究表明，持续感染HBV的树鼩与疑似HBV感染和无HBV感染的树鼩相比，树鼩肝细胞水肿、脂肪和嗜酸性粒细胞变性、淋巴细胞浸润和小胆管增生，慢性HBV感染树鼩肝组织病理学变化与人HBV感染相似。Yang等[6]用感染HBV的树鼩血清继续感染新生树鼩，感染后的新生树鼩显示出HBV感染进展，甚至发展为晚期肝细胞癌，HBV感染的肝脏组织病理学和免疫组织化学变化与人类相似。其研究结果显示树鼩感染HBV和肝细胞癌的特征与人慢性HBV感染相似，树鼩可用于研究慢性HBV感染易感性和疾病进展机制。

miR-122在促进HCV复制中起着重要的积极作用，而miRNA Let-7具有抑制HCV复制的功能。树鼩与人的miR-122二级结构的相似性，树鼩肝脏miR-122的高表达水平、Let-7的低表达水平在HCV感染机制研究中具有优势[7]。基于树鼩以上生物学特点，有学者[8]用HCV体外感染树鼩原代肝细胞，3～15 d后树鼩原代肝细胞中可检测HCV基因组RNA和HCV特异性非结构蛋白5A(NS5A)，但病毒载量较低。静脉注射HCV，感染率为46.7%，肝组织中检测出HCV RNA，提示HCV可感染树鼩且病毒可以在树鼩体内复制。同时，树鼩肝细胞中存在核心蛋白、E2、NS3/4和NS5A四种HCV特异性蛋白。其结果表明HCV感染树鼩后表现出典型的轻度肝炎症状，树鼩可以作为研究HCV感染和复制的动物模型。

3 视觉疾病

对树鼩视觉相关基因的分析表明， 树鼩基因组中包含绝大多数与人类同源的视觉相关基因，是二元色视觉动物。树鼩视锥细胞占光感受器的96%[9]，视锥细胞感受中等或明亮光线和色觉。树鼩视网膜包含两种视锥细胞，包括长波长敏感细胞(LWS) 和短波长敏感细胞(SWS)， 仅比人类少了中波长敏感细胞[10]。因此， 相比于啮齿类动物， 树鼩拥有较为发达的视觉系统，是近视和视网膜疾病良好的动物模型。Levy等[11]研究表明，晶状体近视会增加巩膜循环软化率，树鼩巩膜的循环软化可通过巩膜循环拉伸实现， 而使用京尼平(Genipin， 化学式： C11H14O5)处理后巩膜循环软化率降低。Grytz等[12]建立了多尺度建模评价树鼩眼睛发育和晶状体近视过程中巩膜的生长与重塑，结果显示在眼睛发育过程中，巩膜的生长和重塑涉及两个独立机制。在屈光发育过程中，巩膜接受视网膜生成的信号， 调节其生化特性。其中，视网膜产生双向调节信号“GO”和恢复性信号“STOP”均可引起巩膜重塑，分别减少远视和近视的发展。Guo等[13]比较巩膜接收的“STOP”信号与“GO”信号时的基因表达差异， NPR3、CAPNS1、NGEF、TGFB1、CTGF、NOV、TIMP1和HS6 ST1基因在“GO”和“STOP”信号中具有双向调节作用， “STOP”信号相关基因具有 “G O”信号调节功能，而“GO”信号相关基因无“STO P”信号调节功能。此外， 树鼩晶状体近视和恢复中脉络膜的基因表达特征分析表明， 13个基因在“GO”信号和“S T O P”信号中起双向调节作用(E P H A 1、SCUBE3、BCO2、ZNF185、IGF2、NRG1、PI15、FAM180A、MEST、SOSTDC1、NOV、ADAMTSL3和COL6A6)。“GO”信号特有相关基因12个，包括5个上调基因(P2RY1、RPE65、HIF1A、BMP4和TGFBI)和7个下调基因(CILP、PENK、PTX3、THBS1、CYR61、TIMP3 和 OGN)，“S T O P”特有相关6个上调基因(F G F R 1、CHAT、TGFB2、TGFB3、TNC 和MXRA5)。脉络基因表达网可调控巩膜成纤维细胞基因表达和轴向伸长率[14]。树鼩近视发展与TIMP-2的表达减少有关， TIMP-2低表达提高巩膜内其降解活性，补充TIMP-2显著降低巩膜胶原降解率和近视发展[15]。

树鼩角膜的五层结构及各层结构占角膜厚度的比例与人类极其相似， 从前向后分为角膜上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和角膜内皮层， 树鼩角膜结构特征使其成为研究角膜疾病很好的动物模型。树鼩单纯疱疹病毒(HSV)急性感染期出现与人类疱疹病毒性角膜炎相似的眼部疾病，潜伏期角膜和视神经的组织匀浆上清中均可检测到活病毒， 表明疱疹病毒潜伏感染树鼩模型是研究HSV-1潜伏感染及其引发的角膜炎发病机制的理想动物模型[16]。此外， Th1型细胞因子IL-1β和IL-6浓度均在树鼩真菌性角膜炎第7日达到高峰， 促炎因子IL-1β和IL-6及抑炎因子IL-10在树鼩茄病镰刀菌性角膜炎炎症反应机制中发挥重要作用[17]。

树鼩与人类的视神经有很多相似之处，尤其是在筛板区，并且视神经结缔组织的改变与年龄相关。这些特征使得树鼩能够成为研究青光眼病理生理学改变的理想动物模型。通过向树鼩眼睛前房注射铁磁珠溶液建立青光眼模型，视网膜神经纤维层(RNFL)明显变薄，RNFL厚度和视神经轴突数减少与眼压升高一致。视神经表现出与青光眼视神经病变相一致的病理组织学，即树鼩青光眼模型表现出与人类青光眼相似的病理特征[18]。

以上研究说明，树鼩眼睛解剖结构和生理特征决定了其在视觉系统病变如近视、角膜炎、青光眼方面研究中独特优势。

4 神经系统疾病

研究[19]表明， 大脑前扣带皮层(anterior cingulate cortex， ACC)参与调控感知疼痛和情绪。树鼩的ACC显著大于小鼠和大鼠，且树鼩ACC锥体细胞比小鼠或大鼠ACC锥体细胞大。此外，树鼩ACC锥体神经元的顶端/基底具有丰富的树突分支和树突棘。这些结果表明树鼩ACC的锥体细胞比啮齿动物的锥体细胞更为先进，树鼩可作为研究ACC相关生理和病理变化机制的动物模型。

树鼩前额叶皮层结构与懒猴非常接近，与丘脑之间形成双向投射[20]。而且树鼩具备灵长类动物和人类特征的脑-应激回路(下丘脑-垂体-肾上腺轴)，表现为束缚应激，可引起树鼩皮质醇增高，而啮齿类动物表现为皮质酮增高[21]。树鼩大脑生理结构特征使其在神经系统疾病相关研究中具有巨大的优势，尤其是可作为抑郁症和老年痴呆模型。Schmelting等[22]建立了抑郁症树鼩模型，研究结果提示阿戈美拉汀(Agomelatine)恢复精神紧张的雄性树鼩体温。此外，氯米帕明(Clomipramine)可治疗抑郁症状，如体质量减轻、尿皮质醇升高、不规则皮质醇节律等症状[23]。

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常见的神经退行性疾病之一。其病理学特征是脑实质和血管壁中淀粉样β(Aβ)蛋白大量沉积。树鼩Aβ蛋白序列与人Aβ蛋白的同源性高达9 2%[24]。Yamashita等[25]观察了老年树鼩额叶皮质和伏隔核的老年斑样结构，均发现了衰老的生长抑素免疫反应细胞，推测生长抑素的降解可能与Aβ蛋白积累有关，并可能在衰老过程中损害认知功能。何保丽等[26]通过侧脑室注射Aβ蛋白诱导树鼩AD模型，Lin等[27]将Aβ1-40注射到树鼩海马中，并诱导与神经元凋亡相关的认知损害。以上实验研究为树鼩老年痴呆模型的建立奠定了基础，也表明树鼩在老年痴呆相关研究中具有独特的优势。

5 肿瘤

树鼩生理机能和生化代谢等与人类相似，其表现形式之一，即为树鼩存在与人类症状相似的自发性肿瘤，包括肝细胞癌[28]、乳腺癌[29]、肺癌和淋巴癌[30]。自发性肿瘤通常比实验方法诱发的肿瘤与人类肿瘤症状更为相似，其发病机制与人类肿瘤也更接近。Tong等[31]研究表明，树鼩神经胶质瘤的基因表达谱与人类神经胶质瘤基因表达谱最为接近，自发性肿瘤动物模型有利于将动物实验结果推用到人。自发性肿瘤模型可用于研究遗传因素在肿瘤发生中的作用，如在自发性乳腺癌树鼩群体中检测到高频率的PTEN/PIK3CA突变[32]，且乳腺癌发生和发展过程中关键的转录因子KLF5在树鼩和人类中高度保守[33]。

人为模拟其致癌因素诱导树鼩肿瘤的症状和病程与自发性肿瘤非常类似，如采用7，12-二甲基苯并蒽(DMBA)与醋酸甲羟孕酮联合诱导的乳腺癌树鼩中同样存在自发性乳腺癌PTEN/PIK3CA突变[32]。HBV感染引发的树鼩肝细胞癌中存在p53和p21基因突变[34]。Ye等[35]基于树鼩和人类之间生理和结构相似性，采用气管内导入3-甲基胆蒽(3-MC)和二乙基亚硝胺(DEN)碘化油悬浮液成功诱导树鼩肺癌模型，该模型支气管上皮异常增生，出现原位癌的表观变化。X光检查和 HE 染色证实树鼩是肺癌研究的新型动物模型。对基因组和转录水平进行了药物靶标预测和分析， 预测了3 482个可能成为药物靶标的蛋白质，其中一半以上靶向蛋白比小鼠更接近人靶标，尤其是树鼩血小板蛋白酶激活受体的组成及型表达与人血小板最为相似[36]。

由此可见，树鼩在肝细胞癌、乳腺癌、肺癌和淋巴癌等肿瘤发病机制和抗癌药物筛选相关研究中有巨大的应用潜力。

6 代谢性疾病

树鼩心率较快[(357.00±31.00)次/分]和核心温度较高[(39.59±0.05) ℃]使其成为代谢研究的理想动物模型。树鼩口服葡萄糖耐量试验结果显示，禁食树鼩给予2 g/kg的葡萄糖，血糖在30 min内迅速增加，6 h后血糖水平仍然很高，提示树鼩糖代谢能力较低[37]， 且树鼩中存在自发性糖尿病个体[38]，因此，树鼩可用于糖尿病相关研究。用不同剂量的链脲霉素(streptozotocin， STZ)可建立树鼩中相似的I型[39]和II型糖尿病[40]。Pan等[41]利用树鼩脐带间充质干细胞分化成胰岛样细胞治疗II型糖尿病，脐带间充质干细胞移植可降低糖尿病树鼩的血糖水平，增加胰岛素分泌，降低胰岛素抵抗，促进糖尿病树鼩的组织修复。Pan等[42]利用高糖、高胆固醇、高盐饮食和糖水联合腹腔注射STZ成功建立了树鼩代谢综合征模型，该模型症状与人类代谢综合征症状非常相似，表现为显著的胰岛素抵抗、高血糖、脂质代谢紊乱和高血压症状。树鼩脐带间充质干细胞降低了炎性细胞因子IL-1和IL-6的表达。靶向肝脏、肾脏和胰腺，减少肝细胞变性和坏死，减少肾出血和炎性细胞浸润，降低胰岛细胞变性和坏死，表明脐带间充质干细胞在治疗代谢综合征中起作用。高脂、高胆固醇、高胆酸饮食建立非酒精性脂肪肝，与小鼠脂肪肝模型相比，树鼩模型发病时间短，症状较明显[43]。此外，用乙醇溶液(10%和20%)处理2周，树鼩发生肝细胞肿胀、水肿变性和脂肪肝综合征，乙醇可引起脂肪肝样病理改变， 导致肝功能、氧化应激因子、乙醇代谢酶和Nrf2的改变[44]。因此，树鼩在酒精性和非酒精脂肪肝研究中均有很好的应用前景。

鉴于树鼩生理代谢与人类较为相似，树鼩是研究代谢疾病如糖尿病、代谢综合征、脂肪肝理想的动物模型。

7 问题及挑战

综上，树鼩因其进化上的生物学地位、其感染性疾病和神经功能障碍等多个系统的关键因子及信号通路与人有保守和独特的特征、类人的眼部结构以及与人相似的代谢过程，决定了其在感染性肝病、神经退行性疾病、视觉疾病、肿瘤以及代谢性疾病研究中的优势。目前，以树鼩为实验动物建立了许多症状与人类疾病非常相似的动物模型，用树鼩建立的疾病模型进行相关疾病的发病机制研究也已取得初步的成果。树鼩作为新兴的实验动物，尽管其在生物医学研究中展现出巨大的优势和广阔的应用前景， 但是由于其研究历史短、基础研究的资料薄弱， 与其他成熟的实验动物比较仍有许多问题和挑战： ① 缺乏扎实的基础研究和实验经验的积累。如，树鼩对HBV和HCV感染率低，稳定性差，难以建立持续性感染树鼩模型，因此， 提高HBV和HCV对树鼩的感染性是目前进行病毒性肝炎机制研究面临的挑战。树鼩眼睛发育和晶状体近视过程中调控基因的生物学功能、弱视可塑性与大脑纹状皮层结构的改变仍不清楚; ②缺乏简单、高效的遗传操作技术与方法。目前尤其是开发转基因树鼩和基因敲除树鼩，实现通过观察嵌合体树鼩的生物学性状的变化，检测目的基因的生物学功效，揭示发育过程中调控基因的功能仅仅是开始; ③ 缺乏特异性强的诊断试剂。由于树鼩特殊的分类地位，较多病原体感染的树鼩模型指标评价， 现有的动物和人的诊断试剂不能满足实验需求，急需开发特异性强的检测试剂盒和方法，如适合树鼩研究的ELISA、免疫组织化学、原位杂交和炎性因子等特异性检测试剂盒，树鼩肿瘤的鉴定及肿瘤发展的阶段性标记物检测也较为困难，极大地限制了树鼩在相关研究领域的应用。因此，树鼩广泛应用于人类疾病研究，体现其在生物医学中的优势与价值，不仅需要在不同领域长时期的探索研究，而且需要广大的不同领域的科技工作者精诚合作、资源共享、协同创新，共同突破一系列的关键技术和瓶颈，相信树鼩将为人类健康做出极大的贡献。