不明原因复发性流产机制中Th17细胞和CD4+CD25+调节性T细胞的研究进展

文妍琪，杨菁

(武汉大学人民医院生殖中心，武汉 430060)

复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指与同一性伴侣连续2次或2次以上在妊娠20周前的胎儿(体重≤500 g)丢失者，我国目前的发病率约占育龄妇女的1%～5%[1-2]。其发病原因有很多，包括遗传、解剖、内分泌和血栓前状态、感染以及免疫等。约有一半以上的患者发病原因不明，称之为不明原因复发性流产(Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion，URSA)[3]。

URSA与母胎免疫耐受失衡有着密切的关系。母体蜕膜组织和胎盘滋养层组织共同构成的母-胎界面是妊娠免疫耐受的基础。母胎免疫耐受的建立与维持，需要多种免疫细胞和细胞因子等因素的共同参与[4]。CD4+T细胞亚群在母胎免疫耐受中发挥着重要的调节作用，原始的CD4+T细胞经抗原刺激以后，在不同分化环境中根据其所分泌的细胞因子分化为 Th1 细胞、Th2 细胞、Th17细胞和 CD4+CD25+调节性 T 细胞(Treg细胞)，通过多种途径发挥着不同的生物学功能从而维持免疫耐受[5]。其中Th17和 Treg 细胞是近年来新发现的免疫调节细胞，特别是Th17/Treg细胞亚群的平衡对于维持母胎免疫耐受平衡起着关键的作用。本文主要是对Th17细胞和 Treg细胞在URSA发病机制中的研究现状进行综述。

一、Th17细胞的分化和功能

1.Th17细胞的分化：Th17细胞发现于2005年，不同于其他的CD4+T细胞亚群，主要是一类以分泌细胞因子IL-17为特征的CD4+T细胞亚群。Th17 细胞主要通过其分泌的细胞因子IL-17A(也称为IL-17)、IL-21、IL-22、IL-6、IL-9 等导致组织器官的炎性损伤，具有很强的促炎症作用，从而参与了多种自身免疫性疾病的发生发展[6]。

研究表明初始CD4+T 细胞在炎性因子TGF-β、IL-6、IL-1β、IL-21 和IL-23协同刺激下向Th17细胞分化，需要表达转录因子视黄酸受体相关的维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)并产生细胞因子IL-17，并且TGF-β剂量在Th17的分化中有着重要的作用，高剂量TGF-β单独刺激初始CD4+T 细胞，则向CD4+CD25+调节性 T 细胞(Treg细胞)分化，低剂量TGF-β 与细胞因子IL-6、IL-1β、IL-21 和IL-23 协同刺激初始CD4+T 细胞则向Th17 细胞分化[7]。

Th17 细胞分化的关键核因子是RORγt，其活性可以以配体依赖性方式进行调节，例如乙酰化和泛素化以及与各种辅因子的相互作用。通过对其活性的调节进一步调控Th17细胞的分化。Kim等[8]研究发现，运用特殊的RORγt转录活性抑制剂地高辛可以显著抑制人以及小鼠的Th17细胞的分化，从而降低Th17细胞促炎细胞因子的分泌，其相关的自身免疫性疾病的发生率有所下降。越来越多的小分子RORγt转录活性抑制剂如TMP778和TMPTMP920[9]、A213[10]参与调节Th17细胞的分化。

信号转导和转录活化因子3(STAT3) 途径在Th17细胞的分化中也起着重要的作用，Th17细胞在极化条件下诱导RORγt需依赖于STAT3通路，在IL-6、IL-23等细胞因子的刺激下协同作用促进Th17的分化。Baek等[11]通过体内以及体外实验均证实，应用熊果酸(UA)可以通过抑制STAT3磷酸化降低Th17细胞的数量，并且相关的促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-21和IL-17以及硝基酪氨酸和iNOS的表达降低。过氧化物酶体增长因子活化受体(PPARs)，包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ，是一类被配体激活的核转录因子，属于II型核受体超家族，同时可以调控Th17细胞的分化。PPARα可以通过减少磷酸化信号转导及转录激活蛋白3(p-STAT3)并下调蛋白质表达RORγt，降低Th17细胞分化所必需的细胞因子IL-6的水平从而选择性地抑制Th17细胞的分化。另一方面PPARα 还可以通过抑制RORγt的表达同时增强Foxp3的表达来抑制CD4+T细胞向Th17细胞的分化[12]。干扰素调节因子4(interferon regulatory factor，IRF4)同样在调控Th17分化中起着很重要的作用，Biswas等[13]发现IRF4发生磷酸化，通过 Rho相关激酶2(ROCK2)，影响多种细胞因子分泌，一方面可以促进IL-21以及IL-17分泌，另一方面抑制IL-22分泌从而调节Th17细胞的分化[13-14]。研究表明运用ROCK2的特异性抑制剂KD025可以抑制STAT3通路的磷酸化，下调IRF4以及RORγt的水平，导致IL-17、IL-21的水平降低，并且这种抑制效应与KD025剂量有一定的联系[15]。Tengesdal等[16]通过运用ROCK2的特异性抑制剂KD025表明，ROCK2对Th17细胞的调控效应并不能影响IL-1β、IL-6 以及IL-1α的水平，ROCK2对Th17细胞的调控并不依赖于IL-1途径而是通过STAT3途径实现。Yang等[17]通过运用Slx-2119成功地抑制了ROCK2的活性，伴随着IFN-γ、IL-17A和IL-21的水平显著降低而IL-10显著增加，IL-4水平无明显改变，Th17细胞增加。

2.Th17 细胞的功能：Th17细胞分泌的细胞因子除了IL-17(IL-17A)外，还包括Ⅱ-17F、以及IL-21、I-22、IL-6、TNF-α等细胞因子.

IL-17是一种重要的炎症介质，IL-17家族包含IL-17A～IL-17F，其中IL-17A对于妊娠免疫 最为重要。IL-17 受体(IL-17R) 家族则有5 种受体，为IL-17RA～IL-17RE。IL-17 家族通过与受体结合，参与多种自身免疫性疾病的发病过程[18]。Th17细胞的许多生物学效应都与IL-17密切相关。IL-17通过诱导其他炎症细胞因子如IL-6、TNF、基质细胞分泌集落刺激因子(GM-CSF)和前列腺素E2，以及趋化因子如MCP1、MIP2等的表达，还可介导炎症细胞和T细胞在局部的浸润及组织损伤。同时发现IL-l7也参与了中性粒细胞、树突状细胞(DC)细胞的增殖、成熟及趋化过程等，并能够与一些细胞因子发挥协同作用，促进T细胞的活化，放大靶器官的免疫反应及炎症性破坏等多种生物学作用，参与多种自身免疫病和感染性疾病的发生和发展[19-20]。IL-21是一种自分泌细胞因子，它一方面可以促进Th17 的分化，同时也可以抑制Thl、Treg细胞。

3.Th17细胞与妊娠：Th17有很强的的促炎性作用，关于其在妊娠期的表达目前有不同的观点。有研究显示正常妊娠时体内IL-17的水平较未妊娠时低，Th17/Treg细胞的比例也降低，并且在妊娠晚期Th17细胞水平下降得更多。但是有的研究显示这种差别仅仅只在蜕膜组织中表现，外周血则无明显差别。同时多项研究发现，URSA患者外周血及蜕膜组织中IL-l7水平显著高于正常妊娠者和非妊娠者[21]。RORγt、IL-23等对Th17细胞分化、增殖至关重要的转录因子水平也同样有所增高[21]。

二、Treg细胞

1.Treg细胞的分化：Treg 细胞主要来源于胸腺，小部分可通过外周诱导产生，大部分则是CD4+T细胞自然选择方式产生，分化则主要依赖于T细胞抗原受体与复合体分子-Ⅱ(MHC-Ⅱ)类分子肽或者胸腺内皮递呈的外周自身肽介导。叉头状转录因子(Foxp3)，是 Treg细胞的特异性细胞内标志物。Foxp3存在时，CD4+T细胞可分化 为Treg细胞。研究表明应用曲古抑菌素A(TSA)可以提高Foxp3 乙酰化水平，从而促进CD4+T细胞向Treg细胞分化[22]。IL-2是调节Treg细胞的重要因子，IL-2和抗T细胞受体(TCR)刺激诱导的信号传导对于Treg细胞相关标志物(Foxp3、CTLA-4、PD-1、TGF-β和IL-10)的诱导也非常重要。TCR受到刺激后，CD25、Foxp3、CTLA-4、PD-1 、TGF-β和IL-10的水平都有所增加[23]。

2.Treg细胞的功能：Treg细胞在维持免疫自我耐受、免疫稳态以及调控各种生理和病理免疫反应(包括抗微生物、抗肿瘤反应和移植免疫)方面起着重要的作用。Treg细胞可以通过多种不同的方式杀死应答T细胞，包括颗粒酶和穿孔依赖机制，或者通过向应答T细胞发送负信号。

3.Treg细胞与妊娠：Treg细胞在体内主要发挥特异性抑制的免疫特性。正常妊娠时一定数量的Treg细胞有利于抑制母体免疫系统对父本半同种异体组织的识别。研究表明正常妊娠早期孕妇外周血及蜕膜组织中可以检测到Treg细胞，该细胞能够维持母胎免疫耐受平衡，从而有利于妊娠的维持[24]。

妊娠期间，选择性刺激母体Foxp3+Treg细胞。外周血中Treg细胞数量呈动态变化：早期迅速增殖，中期时达到最高值，分娩以后逐渐下降到妊娠前的水平，其在分娩后很长时间内持续存在[25]。正常妊娠时蜕膜中的Treg细胞也增加并且具有稳定的表型。反复流产的妇女蜕膜中的Treg细胞则明显减少，Treg细胞可作为评估孕妇流产风险的标志物[26]。正常妊娠早孕蜕膜中 Treg细胞的数量显着高于外周血，然而在自然流产患者中却没有这种情况[27]。

三、Th17/Treg失衡与URSA

Th17细胞和Treg细胞两者有内在的联系，分化条件是相互影响的。在缺乏IL-6的条件下，TGF-β1 可以同时刺激Foxp3和RORγt的合成，由于Foxp3和Rorγt的相互作用，从而抑制了Th17细胞的分化[28]。但有IL-6存在时，其可以下调Foxp3，从而促进Rorγt分泌IL-17促进初始T细胞向Th17细胞分化[29]。也有研究证实，TGF-β1不足时Treg细胞可以转化为Th17细胞[30-31]。AMP活化蛋白激酶(AMPK)在T细胞活化和分化中具有重要作用，AMPK活化剂AICAR通过激活脂肪酸氧化抑制体外Th17细胞分化[32]。同样作为AMPK活化剂的二甲双胍则通过下调STAT3介导的信号通路抑制Th17细胞的分化，相关的细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17均有下降，Treg细胞数量增多，Th17/Treg细胞比值下降，通过Th17和Treg平衡的相互调节发挥抗炎作用[33]。多项研究也表明Rho相关激酶2(ROCK2)，一方面可以磷酸化 IRF4从而促进STAT3磷酸化刺激Th17细胞分化，另一方面可以调控STAT1、STAT3、STAT5磷酸化和相关转录因子的表达来促进Treg细胞分化[13-14，17]。

正常妊娠时Th17/Treg 比例是平衡的，两种细胞相互抑制维持着稳定免疫状态；Th17/Treg失衡则会导致炎症反应过强，相对的免疫抑制作用不足，从而导致URSA的发生。研究表明URSA女性外周血和子宫内膜Th17细胞数量多于Treg细胞[29]。IL-27可能参与Th17/Treg平衡的调节，URSA女性蜕膜组织中IL-27水平较低，同时伴随着IL-17的水平升高[34]，IL-27可以激活Foxp3，抑制RORα 和 RoRγt，从而促进Treg细胞分泌IL-10，抑制Th17细胞分泌IL-17，并且这种效应呈现剂量依赖性[35]。人羊膜上皮细胞(hAEC)可以调控初始CD4+T细胞的分化，研究者提取URSA患者外周血并分选出初始的CD4+T细胞与hAEC共培养后发现，hAEC显著抑制CD4+T细胞的活化并且这种效应呈剂量依赖型，同时IL-4、IL-10以及TGF-β1水平显着增加，IFN-γ和IL-17A水平降低，Treg细胞的数量明显增加，说明hAEC可以促进初始CD4+T细胞向Treg细胞分化且同时表达高水平的细胞毒性T细胞相关抗原4(CTLA-4)[36-38]。

吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)可以诱导分化Treg 细胞，IDO缺乏时Treg细胞向Th17 细胞转化[39]。在妊娠期间，较大剂量雌性激素能够有效促进脐血干细胞生成Treg细胞并同时抑制Th17细胞，孕激素则也可抑制脐血干细胞向Th17细胞分化，从而调节Treg的功能[26]。

四、结语

综上所述，妊娠是一个极其复杂的生理过程，需要母体免疫系统的协同参与和精准调节才能维持成功的妊娠。URSA的病因复杂，越来越多的研究显示，造成URSA原因之一是由于母胎免疫耐受遭到破坏，母-胎界面蜕膜免疫细胞Th17/Treg 细胞、Th1/Th2细胞间比例失衡，母体免疫细胞过度激活。Th17 细胞以及Treg 细胞分化发育机制及其相关细胞因子间的调控值得进一步深入研究。通过阻断或加强其关键转录因子的表达维持母胎免疫平衡，有望获得新的治疗URSA 的有效手段。