同性生殖及其研究进展

孟伟，黄佳星，郭旭东

（内蒙古大学，内蒙古呼和浩特 010070）

生物具有产生与自己相似或相同新个体的能力，这种能力被称为生殖能力。生殖是物种延续的必要方式，也是所有生物的基本生理特征之一。但生殖能力在不同物种之间存在着极大的多样性，大多数复杂的高等生物进行有性生殖，即通过由亲本产生的两性生殖细胞结合形成受精卵，受精卵进而发育成新个体，这种生殖方式在减少有害性状的遗传和增加环境适应性方面具有显著的进化益处。然而在自然界中，一些低等植物、部分动物中存在着一种同性生殖的方式——孤雌生殖。“孤雌生殖”这一概念最早在1894年由科学家Owen提出，指卵细胞具有发育成完整胚胎或个体的能力，且在这个过程中并不涉及精子[1]。具体可分为两种类型[2]，一种是由物理化学方法激活卵子，发育过程中不涉及精子的纯粹孤雌生殖；另一种是精子正常进入卵细胞并将其激活，但精子的细胞核并不参与胚胎的发育，胚胎的发育仅在雌核的控制下进行的孤雌生殖。与之相对应的是孤雄生殖，是指仅由雄性个体提供生殖细胞，将两个处理过的精子注入去核卵母细胞，从而获得胚胎甚至单独个体，这在自然界中几乎不存在。在哺乳动物中，同性生殖受到表观遗传基因组印记的限制，有些基因只在母本或父本基因组中表达，导致同性之间无法成功繁殖后代。

1 研究历程与进展

自20世纪90年代起，科学家们开始陆续发现一些特殊的基因。对于大多数基因，它们的父系起源和母系起源的两个等位基因具有相似转录活性，但随着之后的研究发现，哺乳动物中有数百个基因的等位基因的表达因父系母系的来源不同而具有特异性，这些基因被称为印记基因。

1984 年，科 学 家 James McGrath 和 Davor Solter James经过对单细胞期胚胎核移植试验[3]，构建了具备两个雌性原核和两个雄性原核的二倍体小鼠胚胎，证明了在胚胎中只有同时具有双亲染色体才能存活，同时表明父系基因组和母系基因组对胚胎发育的贡献存在差异[3]。1991年后，科学家们几乎在同一时期发现了三个对胚胎发育有重要影响印记基因:Igf2、Igf2r和 H19[4-6]。

2004年，日本东京农业大学的河野友宏（Kono Tomohiro）教授利用未生长的卵母细胞核与成熟的卵母细胞核重建卵母细胞[8]，发现小鼠7号染色体上H19基因[8]和上游的差异甲基化区DMR序列[9]以及12号染色体上Dlk1-Gtl2基因间的DMR序列可阻碍孤雌胚胎印记基因的正常表达，从而导致孤雌胚胎发育能力受限[9]。之后，他们获得全世界第一例由两个母亲所产生的哺乳动物后代。

2009年，Hiromi Miki等[10]科学家将圆形精细胞注入去核卵母细胞，使二者融合并发育，之后在适当的条件下培养，可以获得发育到囊胚期和妊娠中期的小鼠胚胎。但是，直到2018年之前，还没有在哺乳动物中实现孤雄后代。

2018年，Nissim Benvenisty等[11]通过对单倍体胚胎干细胞进行印记基因遗传修饰，首次获得由两位父亲产生的孤雄后代小鼠，以及通过对印记基因的敲除手段得到了由两位母亲所产生的表型基本正常的孤雌后代小鼠。本次研究中取得的突破性进展是，在删除了3个遗传区域后，得到29只孤雌幼崽，且其中7只可以产生自己的后代；在删除了7个遗传区域后，两只雄性小鼠来源的生殖细胞或干细胞结合得到了12只孤雄幼崽。但是，由两个父亲产生的后代幼鼠最终因呼吸困难、组织积液等生理异常仅存活了2天。上述研究结果揭示了一些重要的具有基因印记机制的遗传区域，这些遗传区域可以阻止哺乳动物在没有异性的情况下生殖。

2 生殖机理

2.1 孤雌生殖机理

2018年，Nissim Benvenisty等用人工激活未受精卵母细胞所衍生的、孤雌生殖单倍体胚胎干细胞（phESCs），成功地制备了孤雌小鼠[11]。其过程主要包括三步:（1）在2i培养基中培养单倍体胚胎干细胞，使细胞获得广泛低甲基化，包括擦除母体印记；（2）利用CRISPR-Cas9删除单倍体胚胎干细胞中的一个或两个父系印记区域（IG-DMR、H19-Igf2）；（3）将编辑过的单倍体胚胎干细胞注入成熟卵母细胞。结果显示，单基因座缺失的幼鼠表现出严重迟钝并且在出生后不久死亡，而两个基因座缺失的小鼠可存活至成年并且可繁育出后代。但是，这些小鼠仍然具有生长迟缓、行为异常、胆固醇水平降低和寿命延长等生理现象。之后，在分析这些小鼠的差异基因选择性表达时，他们在精子中发现了一个非常重要的印记基因——Rasgrf1[12]，然后对孤雌单倍体胚胎干细胞中的Rasgrf1基因进行敲除，并由此获得的孤雌小鼠基本上与正常个体繁育出的小鼠一样健康，而且可以繁育后代。

2.2 孤雄生殖机理

除了在制备与正常小鼠生理代谢功能基本已无差异的孤雌小鼠方面取得显著进展外，本次研究[11]最突出的亮点是，孤雄后代首次成功诞生并且实现短期存活。孤雄生殖因其十分复杂的生殖机理，在自然界中是一种难以自发实现的生殖方式。在雄性中，没有相当于孤雌胚胎发生中所使用的、无印记的未成熟卵母细胞，且由于注射了精子的去核卵母细胞具有父系起源和单倍体性，雄性单倍体胚胎干细胞在功能上可以替代卵母细胞注射中的精子，且因其具有广泛低甲基化和类似于原始生殖细胞的状态，所以其中所有亲本印记都不存在。

因为母系印记更为丰富[13]，所以生产孤雄小鼠需要更多的基因敲除。最初他们[11]选择了已知影响胚胎发育的六个印记基因:Nespas、Peg3、Snrpn、Kcnq1、Grb10和Igf2r，并将它们在低甲基化的雄性单倍体胚胎干细胞中删除。将精子和六个基因座缺失的雄性单倍体胚胎干细胞共同注射到去核卵母细胞中，从而产生雄性二倍体胚胎干细胞。然而，六基因座缺失的孤雄小鼠的出生率极低，并在出生后会出现严重的生理异常，例如过度生长、哺乳和呼吸困难等症状，不久之后就会死亡。为了提高双雄原核小鼠的存活率，他们在上述基础上又删除了印记基因Gnas，结果七基因座缺失的孤雄小鼠出生率略高于六基因座缺失小鼠[11]。虽然这些小鼠仅有几种表型的部分改善，但是12只孤雄幼仔在出生后仅存活了48 h。这一结果为培育健康孤雄生殖后代，并最终取得成功提供了有益的线索。

3 同性生殖的意义

3.1 研究孤雌生殖的意义

研究孤雌生殖有助于分析探讨有性生殖与无性生殖的利弊关系。孤雌生殖的研究在进化生物学和保护生物学领域都具有重要意义，利用孤雌生殖的遗传学原理与机制，可以利用编辑已知遗传区域产生无性克隆动物，以增加其子代数目，并且还可以增加物种多样性，在野生动物保护方面有着十分重要的作用[14]。同时，人类孤雌生殖对于人类胚胎学上的研究具有重大意义，很多哺乳动物的试验研究表明孤雌胚胎的发育过程与正常胚胎的发育过程几乎相同。因此，可以利用孤雌胚胎作为人类胚胎学的研究模型，避免了有关伦理问题方面的限制。孤雌生殖的研究为人类治疗性克隆方面开辟一条全新途径，避免了因为利用人类胚胎干细胞治疗而引起的宗教、道德和伦理等问题。因此，孤雌发育体系的建立将为医学临床应用带来广阔的应用前景，它将为解决基因治疗、器官移植、组织修复、疾病治疗等领域的问题提供全新的选择，并且发挥着极其重要的作用。

3.2 研究孤雄生殖的意义

我国会引进优质牲畜品种，以提高当地品种的生产性状。然而，由于许多因素，最优种公畜个体的引进往往很难实现。相对而言，引进最优种公畜个体的精液较为容易，因为精子相对更容易获得、保存、运输，并且无论是死精子还是活性较低的精子都可以通过显微受精技术实施育种。而且从理论上来讲，利用最优种公畜精子，通过孤雄生殖生产后代可以得到遗传物质完全来自于优质品种的家畜后代[15]。沿着这个思路将以性染色体分离为基础的性控育种技术与成熟的孤雄生殖技术结合，可以得到所需性别的优质家畜。这为培育优良品种提供了一个新的思路和方法，在畜牧业方面具有不可估量的发展前途。

4 结语

通过对哺乳动物的同性生殖研究，在探索哺乳动物生殖方式以及生殖机理等领域的道路中发现了一种新的繁殖方式。通过同性生殖，可以得到具有较高科研价值和医学价值的纯系动物。此外，在探索孤雌生殖和孤雄生殖小鼠的过程中，对不同印记区域的遗传修饰的研究，可以视作是未来医学领域临床治疗疾病的一个极具研究价值的初步探索。