β-地中海贫血分子生物学治疗研究进展

马玉媛，刘云春

（大理大学基础医学院，云南大理 671000）

β-地中海贫血是一种具有遗传性的单基因溶血性贫血疾病，发生机制是调控β珠蛋白基因片段的缺失或者突变造成β珠蛋白合成链比例失衡。在全世界范围内，每年出生的患有纯合子或双重杂合子基因型的β-地中海贫血新生儿至少有20万人[1]，常见发病地区有撒哈拉以南的非洲、地中海地区、中东、印度次大陆以及东亚和东南亚[2-3]，我国则集中在南方，主要发生于华南和西南地区，包括广东、广西、海南、四川、云南和贵州等地，其中广东、广西、云南以及海南是地中海贫血的高发区[4]。根据其临床表现，β-地中海贫血可分为轻型、中间型和重型3种，表现为不同程度的进行性溶血性贫血、黄疸、肝脾肿大等，严重的会引起死亡。国内目前仍旧以输血、切脾、造血干细胞移植为主，花费大且治疗效果不一[5]，虽然大量的输血实践结合铁螯合疗法已取得重大进展，并成功地延长了β-地中海贫血患者的预期寿命，提高了生活质量，减轻了并发症，增加了生存率，然而，为了获得最佳的治疗效果，必须在不可逆的铁沉积过多介导心肌、肝、脑组织发生损伤之前尽早开始有效的铁螯合治疗，但是随着新的螯合剂的引入和心脏，肝脏磁共振成像作为监测铁超载方法的治疗手段，治疗成本的增加对于家庭经济和社会医疗体系都是沉重负担[6]。以下将对地中海贫血的疾病机制及减少无效红细胞的生成、铁过载的调节、基因治疗三方面的进展进行论述。

1 疾病分子机制

β-地中海贫血主要是11（p15.5）染色体上β珠蛋白基因点突变引起，也发现有少部分β-地中海贫血是由于β-珠蛋白基因缺失所致[7]。目前，全世界已发现超过200种β-地中海贫血突变型，我国报道发现46种[8］。不同类型珠蛋白链间数量失衡以及受遗传因素和地域环境方面的影响，使得β地中海贫血临床表型多样，从无症状，贫血到严重贫血合并多种并发症（如肺动脉高压、血栓形成、感染、内分泌功能障碍和下肢溃疡等）。按照珠蛋白链缺失程度，珠蛋白肽链合成减少造成部分缺失的（称为β+，轻型突变），珠蛋白肽链不合成造成完全缺失的（称为β0，重型突变），不同组合有不同临床症状。

β珠蛋白基因簇位于第11号染色体，包含珠蛋白基因（HBB）以及其他4种类β-珠蛋白基因：胚胎期表达的ε-珠蛋白基因（HBE1）、胎儿期表达的γ-蛋白基因（HBG2和HBG1）和成年期低量表达的δ-珠蛋白基因（HBD），这些珠蛋白基因的表达调控精密，有高度的发育时序性[9]。人类β珠蛋白基因簇随个体发育的不同阶段而出现特异性表达与关闭，存在胚胎→胎儿→成人的转换，即有两次开关，分别为ε→γ和γ→β（δ）[10]。从受孕到妊娠5周内，胚胎血红蛋白主要在卵黄囊中合成，ε-珠蛋白基因在这段时期表达。第一次基因表达切换发生在怀孕后6周左右：ε-珠蛋白基因表达被逐渐关闭，γ-珠蛋白基因表达开启；从怀孕后12周到胎儿出生这段时间，血红蛋白F（HbF）是胎儿红细胞中最主要的血红蛋白；第二次基因表达切换发生在出生后，γ-珠蛋白基因表达被逐渐关闭，β-珠蛋白基因开始表达；出生6个月后，胎儿血红蛋白的HbF会下降到血红蛋白总量的1%以下，成人血红蛋白HbA达到97%左右，另外2%为HbA2[10]。在对遗传性胎儿血红蛋白持续存在综合征（HPFH）的病人的研究中发现，这是一种由于β-珠蛋白基因簇上的DNA序列缺失或γ-珠蛋白蛋白启动子区域发生点突变导致的成人红细胞中持续存在过量的HbF的遗传性血红蛋白病，无临床症状，不需要治疗。因此，除了直接针对β-珠蛋白基因的表达调控，对γ-珠蛋白基因的表达调控在地中海贫血的治疗上有重要作用，通过对γ-珠蛋白基因的一些调节蛋白或转录因子进行干预，上调γ-珠蛋白的表达，能为β-地中海贫血的治疗提供了更多的研究依据和参考作用。

2 治疗进展

2.1 减少无效红细胞生成的方法

由于珠蛋白基因片段的缺失或者点突变造成珠蛋白合成肽链失衡导致无效红细胞生成是地中海贫血的标志。β-地中海贫血中的β珠蛋白基因部分表达（β+）或表达完全受限（β0）从而使α-珠蛋白肽链相对过剩，不能形成稳定的血红蛋白四聚体，容易氧化沉积形成包涵体沉积在红细胞膜上，红细胞变形能力降低，造成红细胞膜破坏，红细胞寿命缩短，大量无效红细胞生成，引起了严重的溶血性贫血[11]。无效红细胞生成是β-地中海贫血患者慢性贫血和复杂多发病率的关键病理生理机制，目前正在研究许多针对无效红细胞生成的药剂，用于治疗由β-地中海贫血引起的贫血。例如，促红细胞生成素（EPO）、HbF诱导类药物、铁调素等，其中Janus激酶2（JAK2）抑制剂-鲁索利替尼（ruxolitinib）和激活素受体-Ⅱ药物-sotatercept（ACE-011）和luspatercept（ACE-536）处于最先进的研究发展阶段。

2.1.1 促红细胞生成素（EPO）

促红细胞生成素（EPO）是由肾脏在缺氧条件下产生的糖蛋白激素，具有刺激骨髓中红系祖细胞的生长和分化并防止其凋亡的作用。重组人促红细胞生成素（rHuEPO）治疗β-地中海贫血的基本原理来源于狒狒和小鼠的研究[12-13]，结果证明了rHuEPO对刺激HbF合成有益。临床研究中，一直将EPO作为诱导HbF合成来增强红细胞生成的药剂，但是结果表明在很大程度上是具有变化性和不可预测性的[14-15]。rHuEPO可被视为β-中间型地中海贫血患者定期输血的安全替代治疗，特别是脾切除患者以及初始HbF患者＞40%或低EPO水平患者，但对于严重的β-中间地中海贫血患者，需要进一步进行更大规模的临床试验以得到更好的治疗评估效果[16]。另有研究表明，羟基脲（Hydroxyurea，HU）作为治疗镰状细胞贫血的主要药物，同时也是一种核苷二磷酸还原酶抑制剂，存在着诱导HbF生成的作用，在与rHuEPO联合治疗β-中间型地中海贫血患者的过程中显示有良好的治疗优势和安全性[17]。

2.1.2 Jak2抑制剂

红细胞生成受细胞外和细胞内因子的复杂信号通路的调节。EPO是红细胞生成的主要调节因子，EPO经其受体（EPOR）通过多种信号通路主要作用于JAK2/STAT5（Janus激酶2/信号转导和转录激活因子5）。Jak2是Jak酪氨酸激酶家族的成员，它与EPO的关联特别，Jak2是唯一与EPOR相关的激酶，因此也是EPO的唯一信号转导物[18]，Jak2的激活最终导致信号转导和转录激活因子Stat5a和b以及平行信号通路的激活[18]，促进红系祖细胞的增殖、分化和存活[19]。通过抑制JAK2/STAT5途径对β-地中海贫血疾病中EPO过度刺激的负面影响一直是治疗探索过程中有吸引力的领域。作为被美国FDA批准的首批JAK2抑制剂药物之一的鲁索利替尼，一开始被批准用于治疗患有红细胞增多症和骨髓纤维化的患者[20-21]，在治疗的结果中表明，JAK2抑制剂在减少脾肿大方面具有临床疗效，但存在相关的副作用，包括血小板减少和贫血[22]，以及疾病症状的急性复发[23]；在β-地中海贫血中间型的小鼠模型中已显示，JAK2抑制剂可改善无效红细胞生成和逆转脾肿大[24]，最近报道的一项为期30周的二期临床试验中，评估了30例输血依赖性贫血（TDT）和脾肿大患者使用鲁索利替尼的药物疗效和安全性[25]。每天两次鲁索利替尼以10mg的起始剂量口服给药治疗，观察结果表明平均脾脏体积明显减少（第30周时从基线减少26.4%；n=25），最常报告的不良事件是上呼吸道感染（8/30）、恶心（6/30）、上腹痛（5/30）、贫血（5/30）、腹泻（5/30）和体重增加（5/30）[25]。由于红细胞输注量略有减少，但并未减少输血需求，输血前血红蛋白水平也并未有相关改善，导致没有计划对TDT进行进一步的研究。JAK2抑制剂将会是一种有效的治疗选择，理想情况下，JAK2抑制剂可以有助于减少重型β-地中海贫血的输血，缓解非输血依赖性地中海贫血的脾肿大和无效红细胞生成的情况，但其安全性和耐受性目前还尚在研究中。

2.1.3 激活素受体药物（TGF-β超家族）

TGF-β超家族由4组在细胞水平上具有相似结构和调节活性的蛋白质组成：TGF-β、BMP（骨形态发生蛋白）、GDFs（生长和分化因子）和激活素。GDFs或激活素的抑制剂可能对红细胞生成的晚期具有积极的影响，在由无效的红细胞生成引起的贫血，如β-地中海贫血等疾病中具有治疗作用[26]。激活素受体-Ⅱ药物是在细胞外与配体结合的试剂，并且用于阻止在预期受体上的信号传导。它们最初是通过抑制激活素依赖性信号传导来预防破骨细胞依赖性骨吸收，用于改善绝经后妇女的骨密度，但结果意外发现Hb值有了显著的增加[27]。针对激活素受体-Ⅱ（ActRIIA或ActRIIB）开发了两种药物——Sotatercept（ACE-011）和Luspatercept（ACE-536），用于治疗与无效红细胞生成相关的病症。

Luspatercept和sotatercept是结合转化生长因子β（TGF-β）家族配体的重组化合物，是激活素ⅡB型和ⅡA型受体（ActRIIB和ActRIIA）修饰受体，与人免疫球蛋白IgG1的Fc部分融合。因此，它们分别阻止TGF-β超家族配体结合ActRIIB和ActRIIA，抑制通过下游信号传导对Smad2/3通路传导的抑制作用。相对于激活素或其他TGF-β家族成员（例如GDF11）来说，它们具有更强的结合能力[28]，在临床的Ⅰ期和Ⅱ期的初始研究表明[29-30]，使用Luspatercept和sotatercept药物的治疗实验中，地中海贫血人群耐受性良好，血红蛋白水平得到提高，贫血程度改善，输血负荷减少，但确定具有输血依赖性或非输血依赖性β-地中海贫血的成人中可接受的活性剂量还需要在后期的Ⅲ期研究中进行延续性观察。

2.1.4 HbF诱导

自从发现具有胎儿Hb遗传性持续存在的地中海贫血患者（HPFH）具有不太严重的表型[31]以来，研究人员一直致力于提高胎儿Hb（HbF）水平，将胎儿血红蛋白（HbF）合成的再活化作为减轻β-血红蛋白病症状的可行性策略。开发新的基因组工具已经确定了血红蛋白转换的重要天然遗传修饰因子，包括BCL11A、KLF1、HBSIL-MYB、LRF、LSD1、LDB1、组蛋白脱乙酰酶1和2（HDAC1和HDAC2）。miRNA也是有希望的治疗靶标，用于诱导HbF产生，是更有效的新策略。许多新的HbF生产的小分子药理学诱导剂已经处于临床前期和临床开发阶段，例如甲基化抑制剂（5-氮杂胞苷、地西他滨、羟基脲）、细胞毒性和组蛋白去乙酰化酶抑制剂、如丁酸盐衍生物。

最近的分子研究加深了我们对有希望的分子靶标的理解，例如BCL11A、KLF1、MYB、LRF和影响HbF沉默的miRNA。然而，在将这些潜在的遗传修饰物转化为临床治疗之前，需要进行更多的临床前研究[32]。

2.1.5 Forkhead-box-O3（Foxo3）

Forkhead-box-O3（Foxo3）是一种关键的转录因子，发挥着许多基本的生物学功能，包括细胞周期调控、细胞凋亡、DNA修复和代谢和最重要的抗氧化作用，Foxo3通过在红细胞生成的早期阶段上调抗氧化酶来保护细胞免受氧化应激[33]。Foxo3的失活将导致细胞周期改变与成红细胞前体的延迟成熟以及氧化应激介导引起晚期成红细胞的氧化损伤和寿命减少。因此，foxo3在减少无效红细胞生成的过程中发挥着重要作用，虽然在血红蛋白中的作用机制仍待阐述，但作为潜在的HbF诱导剂的Foxo3的活化可有利于改善β-地中海贫血中的贫血。在β-地中海贫血中间型小鼠中，已经发现Foxo3由于EPOR-pI3K/AKT/mTOR途径的持续激活而下调，使用雷帕霉素（mTOR抑制剂）在β-地中海贫血中间型小鼠模型中，观察到通过Foxo3的激活显著改善红细胞成熟，促进了β-珠蛋白产生和缓解贫血状况[34]。二甲双胍作为二型糖尿病治疗的批准药物，同时能作为是Foxo3诱导剂，能通过激活Foxo3诱导HbF的红细胞表达。最新研究[35]表明，在镰状细胞性贫血和非依赖性输血地中海贫血患者正在进行的Ⅰ期临床试验中正在研究其作为HbF诱导剂的用途，虽然已证明二甲双胍能增加红细胞祖细胞中Foxo3的活性，并且在与羟基脲的联合使用中具有累加效应，但正在临床前研究阶段，这些药物需要进一步的评估观察。

2.2 铁过载的调节治疗方式

目前，监管机构已批准3种铁螯合剂用于治疗β-地中海贫血患者的铁过载，其中去铁胺是第一种市售的铁螯合剂，半衰期短需通过皮下注射长时间给药，另外两种口服活性铁螯合剂——去铁酮、地拉罗司的引入代表了β-地中海贫血患者管理的巨大进步。虽然3种铁螯合剂的短期临床疗效相似，但不同器官的疗效可能不同，并且受到可用性、功效和安全性问题的限制，去铁酮和地拉罗司都需要密切和持续的监测以防止不良反应发生。出于需要长期坚持治疗和总治疗费用的考虑，它的治疗满意度仍不是最理想的。此外，FBS0701作为新型的口服去铁药，目前已完成临床Ⅱ期研究，其不良反应要比地拉罗司少1/4，对肾功能影响较小[36]，但较少的临床Ⅰ、Ⅱ期的报道中研究对象仅针对输血依赖型的铁过载患者，也许在后面的临床Ⅲ、Ⅳ期研究中也会将非输血依赖型的铁过载患者纳入研究对象，进一步扩大诊治范围深入研究。针对铁过载的调节治疗方式，现在正在从改善铁调素，调控铁转运蛋白及相关分子方面开展着研究。

2.2.1 改善铁调素

铁调素（Hepcidin）是体内调节铁代谢的重要激素，由HAMP基因编码，生物活性形式的hepcidin是25个小分子氨基酸多肽组成的[37]，主要由肝细胞分泌，通过血液循环发挥作用。无效红细胞生成和慢性组织缺氧抑制铁调素在肝脏合成和分泌。hepcidin的体内低循环水平，又增加了十二指肠摄取铁，从网状内皮系统再释放铁，最终肝脏铁储存过多导致铁过载。在β-地中海贫血小鼠模型中过度表达hepcidin可改善无效红细胞生成，增加血红蛋白水平，逆转脾肿大和铁超负荷[38]。由此，可以通过调控hepcidin的水平来预防β-地中海贫血中的原发性铁超负荷，并且可能减少现有的铁负荷。最近研究发现，Minihepcidins是一种模拟内源性hepcidin活性的短肽[39]，这种微量铁调素的使用显著改善了小鼠模型中的无效红细胞生成、贫血和铁超负荷，有很好的治疗效果。还有报道发现，TMPRSS6是一种跨膜丝氨酸蛋白酶，可减少铁调素的产生[40]，因此可以通过降低TMPRSS6的表达来刺激内源性铁调素的产生。来自地中海贫血小鼠模型的结果表明，TMPRSS6基因的缺失改善了贫血并减少了无效的红细胞生成，脾肿大和铁负荷[41]。有实验表明，使用靶向TMPRSS6的反义寡核苷酸或小干扰RNA已被证明可改善小鼠和其他β地中海贫血临床前模型的贫血和铁超负荷[42]。非输血依赖性地中海贫血（NTDT）患者比使用输血依赖性地中海贫血（TDT）的患者更有可能从操纵铁调素表达的药物中获益，而微型铁调素和TMPRSS6抑制剂仍值得用于输血依赖性地中海贫血（TDT）患者治疗的评估。以铁调素为靶点研发新药或许能面向更广泛的地中海贫血人群疾病的治疗，因此，现在也逐渐成为地中海贫血治疗研究的一个关注热点。

2.2.2 调控铁转运蛋白及相关分子

铁转运蛋白将铁从肠细胞输出到血液循环，并在铁稳态中发挥重要作用。肠道缺氧诱导因子-2α（HIF2alpha）是铁转运蛋白调节铁含量变化的一个关键因子。在地中海贫血小鼠模型中，HIF2alpha在β-地中海贫血的发病机制早期被激活，并有助于铁的积累，HIF2alpha信号的破坏可以纠正β-地中海贫血小鼠模型中的铁超负荷[44]。

2.3 基因编辑和基因治疗

2.3.1 基因编辑

基因编辑技术的产生使得基因突变疾病的治愈成为了可能，基因编辑技术可以实现对特定位点基因进行“编辑”，修饰造血干细胞的内源DNA。常用的基因编辑技术有锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）、规律成簇间隔短回文重复基因编辑技术（（CRISPR/Cas9）。在可编程靶向核酸酶应用之前，主要是通过外源性引入染色体模板触发哺乳动物细胞内同源重组途径[45]，在没有其他核酸酶的情况下，利用聚核苷酸来触发同源重组途径，同时利用病毒携带基因作为模板进行基因编辑[46]。当前，使用最多病毒载体包括逆病毒载体（Retro virus vector，RV）和腺病毒相关病毒（Adenovirus associated virus，AAV）载体。RV具有宿主范围广、转染效率高，整合的外源基因可在靶细胞中永久表达等优点，但存在明显的遗传稳定性、使用安全性等方面的隐患；AAV安全性虽然相对较高，但感染效率偏低，亦可能引起免疫排斥等方面不足。当前实验表明，慢病毒（Lentiviral，LV）是基因治疗的最为有效的转移载体[47]。但是，反转录病毒整合可能干扰基因功能，同时也存在一定诱发癌变的风险。基因正确导入和基因充分表达是首要的关注问题。涉及基因组的同源重组，以慢病毒作载体导入患者体内，而动物实验表明慢病毒能激活原癌基因，增加肿瘤发生的风险以及可能发生基因移位随机插入导致基因表达不足的问题[48]。优化载体的构建，提高转染的效率和保证载体的稳定也是目前研究需要解决的关键问题。

针对地中海贫血疾病而言，许多患者的β-地中海贫血的发生是单个位点突变引起，这有助于使用基因编辑策略进行校正。但β-地中海贫血相关的众多突变超过200多种，突变位点因地域不一，存在高度异质性，因此基因编辑运用的一个关键挑战是确定有利于广泛人群的分子靶标。

2.3.2 基因治疗

β地中海贫血的基因治疗根据分子机制可以通过修复β-珠蛋白基因（HBB），或者重新激活γ-珠蛋白基因（HBG）诱导HbF的增加，平衡α和β-珠蛋白肽链的比例，改善红细胞生成，从而达到有效治疗目的。

使用自体干细胞的基因治疗可以作为造血干细胞移植（HSCT）另一种治疗方法，HSCT仅限于具有适当匹配供体的患者。分离造血干细胞和祖细胞（HSPCs），使用慢病毒载体将外源性β-或γ-珠蛋白基因整合到宿主细胞基因组中。在完全或部分清髓后，遗传修饰的自体HSPC返回患者，其中修饰的细胞重新填充造血。人类CD34[49]细胞的慢病毒载体转导现已成为一种成熟的技术，在一些患有严重联合免疫缺陷或代谢紊乱的患者中产生了治愈反应，这种方法使用相对较弱的增强子和启动子，迄今已被证明是安全的。还有依赖于靶向基因编辑的替代方法，如利用CRISPR/Cas9系统在β-地中海贫血患者的人造血干细胞（CD34+）上将α-珠蛋白MCS-R2增强子进行删除突变，形成α-地中海贫血。编辑后的CD34+细胞分化为成熟红细胞，导致减少α-珠蛋白表达，纠正肽链中的α与β珠蛋白的不平衡，改善了病理状况[50]。由于在真正的造血干细胞（HSC）中存在核酸酶有效编辑靶向基因组DNA的困难，靶向基因递送方法在临床适用性受限。在使用靶向编辑做基因治疗研究的同时需要更好地定义靶核酸酶的遗传毒性（脱靶活性），通过不断改进和完善，有望成为治疗β-地中海贫血最适合的手段。

3 结语

地中海贫血作为全球分布最广泛、危害最大的遗传性疾病，其管理和治疗在全球都是巨大的负担。十几年来，β-地中海贫血的管理与治疗都取得了很大的进步，新型分子靶向药物的研发针对不同类型的地中海贫血患者都取得了一定的疗效，一些在临床前期研究的药物，虽然存在很多的治疗局限性和病理机制的不明确，但有很大发展潜力有待改善和明确。基因治疗在β-地中海贫血治疗中有很大的前景，大量实验证明方法的有效性的同时也要关注其治疗的远期疗效和安全性。随着疾病相关机制的不断明确，一些药理学或遗传学的新治疗靶点有望被继续发现。