结肠癌组织中E2F7蛋白表达变化及意义

陈震龙，支巧明，匡玉庭

(苏州大学附属第一医院，江苏苏州215000)

结肠癌的发生发展主要与遗传、炎性肠病、低纤维饮食、大量饮酒、吸烟和肥胖等因素有关[1]。因为环境污染、饮食结构不合理、生活压力大等，近年来结肠癌的发病率呈逐年上升趋势，全球每年新发病例超过100万[2]。晚期结肠癌患者5年生存率较低[3]，肿瘤复发、远处转移是导致患者死亡的主要原因[4]。因此探讨结肠癌的转移、侵袭机制并寻找新的治疗靶标非常必要。E2F7是近年来新发现的非典型E2F转录因子家族(E2Fs)成员，拥有2个独特的DNA结合域，而缺乏典型的RB蛋白结合区域[5]。研究发现，E2F7在子宫内膜癌[6]、卵巢癌[7]、皮肤鳞状细胞癌[8]等多种恶性肿瘤组织中表达上调。miRNA-26a可靶向抑制E2F7表达，以促进急性髓性白血病肿瘤细胞增殖并抑制单核细胞分化[9]。目前E2F7在结肠癌中的相关研究甚少，Liu等[10]发现敲低E2F7表达可以逆转全反式维甲酸ATRA和miR-3666抑制剂对结直肠癌HCT116细胞恶性行为的联合作用，抑制肿瘤的生长、侵袭、转移。本研究探讨结肠癌组织中E2F7蛋白表达变化及其与上皮-间质转化(EMT)的关系。

1 资料与方法

1.1 临床材料 收集2017年1～12月本院收治的原发性结肠癌患者65例，均接受手术治疗，术中取癌组织经病理检查确诊；男34例、女31例，年龄31～82(54.5±10.8)岁；肿瘤高分化22例，中分化15例，低分化28例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期31例；淋巴结转移36例，远处转移16例；术前均未接受辅助放化疗及靶向药物治疗。另选取其中15例患者的癌旁正常组织(距肿瘤边缘>5 cm)作为对照，男8例、女7例，年龄34～73(53.0±11.1)岁。两种组织的患者性别、年龄均有可比性。切取的肿瘤组织与癌旁正常组织标本均用甲醛固定。患者均签署知情同意书，且本研究获苏州大学附属第一医院伦理委员会批准。

1.2 结肠癌组织及结肠正常组织中E2F7、E-cadherin及vimentin蛋白检测 采用免疫组化法。组织标本经固定、石蜡包埋，制成4 μm厚的切片。石蜡切片用二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；用10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)进行高压抗原修复；3% H2O2中浸泡10 min，以消除内源性过氧化物酶活性；1×PBS洗涤后用10%胎牛血清封闭，37 ℃孵育1 h；滴加稀释好的一抗，4 ℃过夜；1×PBS洗涤后用生物素化二抗处理样品,二氨基联苯胺显像，苏木素复染，封片。兔抗人E2F7多克隆抗体购于英国Abcam公司，兔抗人EMT相关因子(E-cadherin、vimentin)多克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司，免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒均订购于上海优宁维生物科技股份有限公司，其他试剂和设备均由苏州大学附属第一医院中心试验室提供。阳性结果判定：在400倍镜下每张切片随机选取5个视野进行观察，每个视野计数约100个细胞，以胞膜、胞质或胞核含棕黄色颗粒判定为表达阳性，并进行评分。细胞染色强度评分：细胞未染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞比例评分：阳性细胞比例<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。两项评分乘积≤2为表达阴性，>2为表达阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。采用Mann-WhitneyU检验比较结肠癌组织与癌旁正常组织中蛋白阳性表达率，采用四格表卡方检验或精确概率法分析E2F7蛋白表达与临床病理特征的关系，用Spearman秩相关分析E2F7与E-cadherin、vimentin蛋白表达的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织及结肠正常组织中E2F7、E-cadherin、vimentin蛋白表达比较 E2F7蛋白主要定位于细胞核中，E-cadherin蛋白主要定位于细胞膜上，vimentin蛋白主要定位于胞质中。结肠癌组织及结肠正常组织中E2F7蛋白阳性表达率分别为78.5%(51/65)、33.3%(5/15)，E-cadherin蛋白阳性表达率分别为29.2%(19/65)、73.3%(11/15)，vimentin蛋白阳性表达率分别为80%(52/65)、13%(2/15)。与结肠正常组织比较，结肠癌组织中E2F7、vimentin蛋白阳性表达率高(P均<0.05)，E-cadherin蛋白阳性表达率低(P<0.05)。

2.2 结肠癌组织中E2F7蛋白阳性表达与患者临床病理特征的关系 结肠癌组织中E2F7蛋白阳性表达率与肿瘤直径、淋巴结转移和TNM分期有关(P均<0.05)，与患者年龄、性别及组织分化程度无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 结肠癌组织中E2F7蛋白表达与E-cadherin、vimentin蛋白表达的相关性 Spearman秩相关分析结果显示，结肠癌组织中E2F7蛋白表达与E-cadherin蛋白表达呈负相关(r=-0.39，P=0.001)，与vimentin蛋白表达呈正相关(r=0.53，P<0.01)。

3 讨论

研究发现，E2Fs参与细胞增殖、分化、凋亡、周期调控和DNA损伤应答过程。迄今为止，已发现E2Fs的8个家族成员(E2F1～8)[11,12]。根据功能，E2Fs分为转录激活因子(E2F1～3)和转录抑制因子(E2F4～8)；根据其结构特点，则可分为典型E2Fs(E2F1～6)和非典型E2Fs(E2F7、8)。目前有关E2Fs成员在肿瘤的发生发展中作用机制的研究已取得不错进展，部分E2Fs成员在肿瘤诊断与治疗等方面的临床价值已得到肯定[13]。E2F7是近年来新发现的非典型E2Fs成员，与典型E2Fs不同，E2F7缺乏与同分化调控蛋白结合所需的DIM域以及介导基因转录的反式激活结构域，取而代之的是2个包含异二聚体残基的非典型DNA结合域，因此E2F7可通过非DP蛋白依赖的方式与DNA结合，以发挥转录抑制作用[14,15]。

表1 结肠癌组织中E2F7蛋白阳性表达与患者临床病理特征的关系(例)

有研究认为E2F7可通过抑制增殖相关miRNA的转录来抑制细胞的增殖能力[16]。但近年来随着对E2F7深入研究，发现其在许多恶性肿瘤组织中可能发挥着促癌作用。E2F7在神经胶质瘤组织中表达上调，可作为神经胶质瘤的独立预后标记物[17]。Chu等[18]研究显示在乳腺癌中过表达E2F7可以抑制miR-15a/16转录，使Cyclin E1和Bcl-2表达上调，进而增强了乳腺癌细胞对他莫昔芬的耐药性。也有研究表明在非小细胞肺癌组织中，miR-935可通过靶向抑制E2F7表达来抑制肿瘤的转移和侵袭[19]。在胆囊癌组织中过表达E2F7可促进肿瘤细胞的迁移，而抑制E2F7表达能同时增加E-cadherin表达并降低vimentin的表达，以推动EMT过程[20]。提示E2F7可能参与肿瘤的侵袭和迁移，并影响EMT过程。

EMT是指上皮细胞在某些特定条件下发生转化，失去细胞极性而获得侵袭性、运动性、抗凋亡性等间充质细胞表型特征的生物学过程，包含复杂的分子机制[21,22]。EMT不仅是胚胎发育的关键机制，还在成人慢性炎症、组织再生、创伤修复和器官纤维化等生理病理过程中发挥重要作用[23]。研究表明，EMT是肿瘤细胞获得侵袭能力的关键步骤，与肿瘤的转移和侵袭密切相关[24]。E-cadherin是典型的上皮细胞标志分子，参与维持细胞连接。研究表明E-cadherin缺失是EMT过程的一个早期事件，会导致细胞急性复合体的破坏，这是细胞发生分裂、侵袭的前提[25]。vimentin是只存在于间质细胞中的细胞骨架蛋白，其在各种恶性肿瘤中的表达与肿瘤的侵袭、转移密切相关[26]。E-cadherin和vimentin都是EMT最具代表性的分子标志物，E-cadherin表达失活和vimentin表达上调是EMT发生的关键环节之一[27,28]。

本研究发现，结肠癌组织中E2F7蛋白阳性表达率明显高于癌旁正常组织，提示E2F7在结肠癌组织中呈高表达；而E-cadherin和vimentin在结肠癌组织中的表达也与EMT基因表达谱相符。E2F7蛋白阳性表达的结肠癌患者，其肿瘤直径更大、TNM分期更晚，且更容易发生淋巴结转移。表明E2F7可能具有促进结肠癌生长、转移、侵袭的作用。为进一步阐明E2F7参与肿瘤转移和侵袭的作用机制，分析结肠癌组织中E2F7与E-cadherin及vimentin蛋白表达的相关性，结果表明E2F7与E-cadherin蛋白表达呈负相关，而与vimentin蛋白表达呈正相关。提示E2F7参与推动EMT的发生。

综上所述，E2F7在结肠癌组织中呈高表达，E2F7高表达可能促进结肠癌的生长、转移和侵袭，其对肿瘤转移侵袭的促进可能是通过EMT过程来实现的，E2F7可能成为结肠癌治疗的新型靶标。但本研究收集的样本数量有限，需要增加样本量来证实以上结果，并且E2F7在结肠癌中的作用通路有待进一步阐明。