谷氨酰胺转氨酶在Yarrowia lipolytica中的活性表达

任蕊蕊,刘 松,李江华,堵国成,陈 坚

(1.江南大学 生物工程学院，无锡 214122；2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122)

谷氨酰胺转氨酶(EC 2.3.2.13,Transglutaminase,TGase)可以催化肽链中的谷氨酰胺残基中的γ-羧酰胺基与酰基受体发生转酰基反应，从而使蛋白质或多肽之间发生共价交联[1]。基于特殊的催化反应，TGase可使蛋白质与赖氨酸交联，提升食品的营养价值[2]；也可改善蛋白类食品功能的特性，如持水性、黏性、乳化稳定性，减少储藏损失和烹饪损失[3]。因此，TGase在食品加工领域有着广泛的应用。近年来，TGase在生物技术研究和医药[4-7]、纺织业[8]及皮革加工[9]等领域亦展现了较大的应用前景。

基于N-端酶原区对折叠与分泌的重要影响[10-11]，TGase通常以无活性的酶原(pro-TGase)形式在异源宿主中表达，再经体外蛋白酶切除酶原区后才得到活性TGase[12-13]。显然，这种TGase表达策略不利于工业化生产。近年来异源表达活性TGase的策略主要有两种：pro-TGase与活化蛋白酶共表达；酶原与成熟TGase共表达。Kikuchi等[14]在谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中共表达pro-TGase与蛋白酶SAM-P45，活性TGase产量达到142 mg/L。Yurimoto等[15]与李鹏飞等[16]分别在甲醇营养型酵母(Methylotrophicyeasts)和毕赤酵母(Pichiapastoris)中共表达，实现了活性TGase的分泌。

尽管研究者已成功获得TGase在C.glutamicum和P.pastoris等宿主菌中的活性表达，但总体产酶水平不高。解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)为食品安全菌[17]，发酵中不需诱导或添加抗生素，能用于食品和药品相关酶或蛋白的生产[18]。本研究拟以Y.lipolytica为宿主，通过共表达茂源链霉菌(Streptomycesmobaraensis)谷氨酰胺转氨酶激活金属蛋白酶(TAMEP)[12-13,19]及在TGase N-端插入宿主Kex2蛋白酶识别位点(KR)[20]，实现活性TGase高效分泌表达。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

TGase基因来源菌株S.mobaraensis、质粒pINA1297/N355Q[21]、pINA1297、Y.lipolyticapo1h/1297[21]和宿主菌Y.lipolyticapo1h由江南大学生物系统与生物加工工程研究室保藏。pUC57/TAMEP由上海睿迪生物科技有限公司合成。

1.1.2 酶、试剂、引物和DNA序列测定

限制性核酸内切酶购自Thermo Fisher Scientific公司，胶回收试剂盒和Competent Cell Preparation Kit试剂盒购自Takara(大连)公司，Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司。引物合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.1.3 培养基

种子培养基(YPD，g/L)：酵母膏 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20。

筛选培养基(酵母基础氮源培养基，YNB，g/L)：YNB 6.7，葡萄糖20。

固体培养基则是在液体培养基中加2%的琼脂。

发酵培养基(g/L)：甘油 15，酵母膏 20，氯化铵2.64，磷酸二氢钾 0.32，无水硫酸镁 0.25，维生素B13.34×10-4，调pH 8.0。

1.2 方法

1.2.1S.mobaraensis基因组的提取

用FastPrep破碎仪破碎菌体，破碎强度为6.5，破碎时间为20 s，每个样品破碎10次。然后用植物基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因组，具体操作按说明书进行。

1.2.2 质粒pINA1297/pro-TGase的构建

以pINA1297/N355Q为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增含有酶原区pro的pINA1297表达载体。以基因组为模板，P3和P4为引物进行PCR扩增TGase基因片段。两种PCR产物经DpnI消化后进行胶回收，回收产物以摩尔比为1∶2进行混合，使用One Step Cloning Kit进行连接后，转化E.coliJM109，获得表达载体pINA1297/pro-TGase。

1.2.3 插入Kex2蛋白酶识别位点重组质粒pINA1297/pro-KR-TGase的构建

以质粒pINA1297/pro-TGase为模板，P5和P4引物进行PCR，扩增含有已加入Kex2蛋白酶识别位点(KR)[20]的茂源链霉菌TGase基因片段。PCR产物经DpnI消化后进行胶回收，再以回收产物作为引物，以质粒pINA1297/pro-TGase为模板进行大引物PCR，获得突变基因片段。PCR产物经DpnI消化后进行胶回收，转化E.coliJM109，获得重组质粒pINA1297/pro-KR-TGase。

1.2.4 活化蛋白酶重组质粒pINA1297/TAMEP的构建

以质粒pINA1297/N355Q为模板，P1和P2为引物进行PCR，通过PCR扩增含有酶原区的pINA1297表达载体。以pUC57/TAMEP为模板，P6和P7为引物进行PCR，通过PCR扩增TAMEP基因。两种PCR产物经DpnI消化后进行胶回收，回收产物以摩尔比为1∶2进行混合，使用One Step Cloning Kit进行连接后，转化E.coliJM109，获得重组质粒pINA1297/TAMEP。

1.2.5Y.lipolytica的转化与重组子的筛选

重组质粒经快切酶NotI酶切后，胶回收得到相应的线性化质粒。然后用醋酸锂转化法[22]转化Y.lipolyticapo1h感受态，质粒通过zata整合位点将突变基因整合到Y.lipolyticapo1h(Ura-，ΔAEP，ΔAXP，Suc+)基因组中。整合成功的Y.lipolyticapo1h会使其从尿嘧啶(ura)缺陷型菌株转化为非缺陷型菌株。通过缺乏ura的YNB培养基28℃，培养3～6 d后，获得重组菌的阳性转化子。

基于上述转化方法，将pINA1297/pro-TGase转化Y.lipolyticapo1h感受态获得重组Y.lipolyticapo1h/pro-TGase；将pINA1297/pro-KR-TGase转化Y.lipolyticapo1h感受态获得重组Y.lipolyticapo1h/pro-KR-TGase；将pINA1297/TAMEP转化Y.lipolyticapo1h/pro-TGase感受态获得重组Y.lipolyticapo1h/HM+HT。

表1 基因克隆及定点突变引物Table 1 Primers used for gene cloning and site-specific mutagenesis

1.2.6 重组Y.lipolytica的发酵

选取10～15个重组菌的阳性转化子，接种于YPD液体培养基中，于28℃，200 r/min的摇床中培养24 h。将种子液以10%的接种量转接于发酵培养基中，28℃，200 r/min摇瓶培养120 h。

1.2.7 TGase的酶活测定

采用比色法测定TGase酶活[23]。1个单位的酶活定义为：在37℃的条件下，每分钟催化α-N-CBZ-GLN-GLY[24](Sigma)合成1 μmol 的L-谷氨酸-γ-单轻胺酸所用的酶量(U/mL)。

1.2.8 菌体量的测定

利用紫外可见光分光光度计(UV2450，Shimadzu，日本)检测菌液在600 nm波长处的吸光度值，即OD600。

1.2.9 纯化方法

1.2.10 浓度的测定

蛋白质浓度测定采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，具体按说明书操作。

1.2.11 动力学常数的测定

在底物浓度为0～30 mg/mL范围内设定浓度梯度，均按1.2.6中所述的方法测酶活，通过双倒数作图法计算可得动力学参数Km值。

2 结果与分析

2.1 重组Y.lipolytica po1h/pro-KR-TGase的构建及摇瓶发酵

将S.mobaraensispro-TGase基因克隆至pINA297得到表达质粒pINA297/pro-TGase(图1)，转化Y.lipolyticapo1h得到的重组菌Y.lipolyticapo1h/pro-TGase。发酵分析显示，Y.lipolyticapo1h/pro-TGase上清液检测到TGase活力仅为0.13 U/mL，但在49 ku左右具有明显的pro-TGase电泳条带(图2)，大于理论值43 ku，可能是由于酶表达时发生了糖基化[21]。上述结果表明，pro-TGase在Y.lipolytica中能高效表达，但不能高效转化为活性TGase。

A：pINA297/pro-TGase；B：pINA297/pro-KR-TGase；C：pINA297/TAMEP

图1重组质粒示意图
Figure 1 The plasmids constructed in this study

M：Marker；1：Y.lipolyticapo1h/1297；2：Y.lipolyticapo1h/ pro-TGase

图2Y.lipolyticapo1h/pro-TGase生产TGase SDS-PAGE分析图
Figure 2 The SDS-PAGE analysis of TGase produced byY.lipolyticapo1h/pro-TGase

Kex2蛋白酶属于亚麻酶家族，该家族的酶识别位点专一，具有将酶原区加工成有活性酶的功能[25]。Richard等[26]发现了Kex2蛋白酶也存在于Y.lipolytica中。因此，本研究采用在酶原区与TGase之间加入Kex2蛋白酶的识别位点KR[20]的策略，构建了质粒表达载体pINA1297/pro-KR-TGase(图1-B)，确认pro-KR-TGase基因序列与公布的序列完全一致。质粒经NotI线性化后转化Y.lipolyticapo1h感受态获得重组Y.lipolyticapo1h/pro-KR-TGase。酶活测定和SDS-PAGE检测发现：发酵0～20 h酶活变化很小，几乎全部以非活性酶原的形式表达；20～76 h，TGase的活性基本呈直线上升，最高酶活达5.26 U/mL；76～120 h后，TGase持续降解，活性基本呈直线下降(图3-A、B)。结果表明，添加Kex2蛋白酶识别位点明显促进了pro-TGase转化为活性TGase的效率。

图3重组菌Y.lipolyticapo1h/ pro-KR-TGase发酵生产TGase的活性(A)及SDS-PAGE分析(B)
Figure 3 The production of TGase byY.lipolyticapo1h/ pro-KR-TGase in shake flask(A),and its SDS-PAGE analysis(B)

2.2 重组菌Y.lipolytica po1h/HM+HT的构建和摇瓶发酵

TAMEP蛋白酶最初从S.mobaraensis中分离出来，可以识别酶原区pro序列C-端的FRAP，从而可以切除酶原区，使pro-TGase转化为活性TGase[19]。由于Y.lipolytica中没有TAMEP，本研究首次采用共表达pro-TGase与TAMEP的方法，构建了重组Y.lipolytica/HM+HT。重组菌摇瓶发酵，酶活测定和SDS-PAGE分析结果显示，重组菌Y.lipolyticapo1h/HM+HT发酵 0～20 h酶活变化很小，几乎全部以非活性酶原的形式表达；20～110 h，TGase活性基本呈线性缓慢增长，并达到最大值6.77 U/mL(图4-A、B)；110～120 h，TGase酶活有下降趋势。结果表明，添加共表达TAMEP明显促进了pro-TGase转化为活性TGase的效率。

2.3 酶反应动力学分析

图4重组菌Y.lipolyticapo1h/ HM+HT发酵生产TGase的活性(A)及SDS-PAGE分析(B)
Figure 4 The production of TGase byY.lipolyticapo1h/HM+HT in shake flask(A),and its SDS-PAGE analysis (B)

M：Marker；1：pro-KR-TGase；2：HM+HT

图5 pro-KR-TGase及HM+HT纯化后SDS-PAGE分析
Figure 5 The SDS-PAGE analysis of pro-KR-TGase and HM+HT

糖基化对酶的正确折叠、分泌、酶活力、酶亲和力、底物特异性等具有重要影响[27]。王小燕等[28]通过对β-葡萄糖醛酸苷酶N115和N418进行糖基化修饰提高了酶对底物的亲和力，对N26和N150进行糖基化修饰提高了酶的催化效率。pro-TGase在Y.lipolytica中表达时会发生糖基化[21]，而S.mobaraensisTGase未发生糖基化。因此，糖基化可能是导致本研究中TGase的比酶活、酶与底物亲和力和催化活力等性质优于S.mobaraensisTGase的重要原因。

表2 TGase及其突变体酶学特性Table 2 Enzyme properties of TGase and its mutants

3 讨论

为促进活性TGase的异源表达，研究者开展了大量的工作。Kikuchi等[14]在C.glutamicum中共表达pro-TGase与蛋白酶SAM-P45，活性TGase产量达到142 mg/L。Yurimoto等[15]在M.yeasts中将pro和TGase作为两个独立的元件进行共表达，得到的TGase产量为1.83 U/mL；李鹏飞等[16]利用同样的方法在P.pastoris中实现了活性TGase的分泌表达，摇瓶产量最高为0.25 U/mL。本研究通过在pro与TGase直接插入Kex2识别位点KR和共表达pro-TGase与活化蛋白酶TAMEP两种策略，均获得了活性TGase的分泌，摇瓶发酵酶活分别可达5.26 U/mL和6.77 U/mL。与其它报道相比，本研究获得的活性TGase具有产量优势。此外，与S.mobaraensis成熟TGase相比，通过以上两种策略得到的成熟TGase的比酶活；酶与底物的亲和力Km及酶的催化效率kcat/Km等酶学性质明显提高。为TGase的工业化生产提供了新型高产菌种。

图6 谷氨酰胺转氨酶TGase的3-D结构Figure 6 Analysis on 3-D structure of TGase

黄色和紫色分别代表TGase的KR和FRPAP所在TGase 3-D结构的位置(yellow part represents the position of the amino acid sequence Lys-Arg in the TGase 3-D structure,and the purple part represents the location of Phe-Arg-Pro-Ala-Pro)

采用策略1构建的重组菌Y.lipolytica/pro-KR-TGase，在发酵76 h时酶活达到最高，但在发酵76 h之后存在成熟TGase持续降解的现象。其可能的原因是：S.mobaraensisTGase的第214～215位氨基酸序列为KR，位于一段较短的α-螺旋上，且位于酶蛋白表面(图6)，可以被Kex2蛋白酶识别并切割，导致成熟TGase降解。采用策略2构建的重组菌Y.lipolytica/HM+HT，在发酵110 h时酶活达到最高，但在发酵86 h之后也存在成熟TGase持续降解的现象。其可能的原因是：成熟区TGase第223～227的氨基酸序列为FRPAP，位于TGase的一段loop环上，也位于酶蛋白表面(图6)，且该序列与TAMEP蛋白酶的识别位点相似，易于被TAMEP识别并切割，进而导致成熟TGase降解。在后续研究中，将进一步鉴定TGase内部的Kex2和TAMEP蛋白酶识别位点，抑制发酵后期活性TGase的持续降解。