沈玺龙,李永霞, 张群英
(贵州省植物园,贵州 贵阳 550000)
树莓(Raspberry)为蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus L.)多年生开花植物,中药名为覆盆子,为药食同源植物,是第三代水果的典型代表。其广泛分布在欧洲、亚洲、北美洲等的温带气候区,并且自公元4世纪便被作为食物和药物使用[1]。其富含多种营养、保健成分[2],具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌抗炎、降低血液胆固醇[3-5]等药用功效。树莓鞣花酸可提取于树莓植株的茎、叶和果实,是树莓提取物中所占比较重要的活性成分之一。树莓鞣花酸的生物活性,现已成为研究的热点,同时,对树莓鞣花酸不同提取与纯化方法的建立与优化也备受关注。本文就近年来树莓鞣花酸的提取、纯化、含量测定以及生物活性等方面对树莓鞣花酸的研究作一综述。
鞣花酸提取方法有:乙酸乙酯萃取法[6]、酸水解法[7]、分离沉淀法[8]等,但大都提取过程复杂耗时较长,且在提取过程中鞣花酸容易分解,耗时长、得率低。近年来随着技术的发展,鞣花酸的提取方法也有了极大改善,将溶剂提取与微波辅助相结合的微波辅助溶剂浸提法已成为现今鞣花酸提取的主流[9]。微波辅助溶剂浸提法耗时较少,且相对简便快捷,在减少提取用时的同时,又能保护鞣花酸防止分解,大大提取高鞣花酸得率。
李小萍[10]等使用丙酮、甲醇、乙醇、盐酸作为红树莓果实中鞣花酸提取的提取溶剂,对比不同溶剂条件下红树莓果实中鞣花酸的提取效果。通过实验对比,确定丙酮提取的效果较其他三种提取溶剂好。将丙酮作为鞣花酸提取溶剂,通过单因素正交试验分析得出红树莓中鞣花酸提取的最佳条件为:提取液85%丙酮、料液比1∶12、时间90min、温度80℃。在此条件下提取红树莓果实中的鞣花酸,得到的鞣花酸含量为322μg/g。王佳慧[9]等在试验中使用超声波辅助溶剂浸提法提取树莓中的鞣花酸,将无水乙醇作为鞣花酸的提取溶剂,超声波辅助提取。响应面分析法对试验结果进行优化组合分析,确定了鞣花酸提取的最佳工艺为温度80.02℃、提取时间19.72min、料液比1∶14.04,在此条件下提取得到的树莓鞣花酸可以达到670.28μg/g。进一步确定影响树莓中鞣花酸提取的主要因素,利用单因素试验验证温度、提取时间、料液比等条件下鞣花酸得率,最终得出料液比对鞣花酸得率的影响要超过提取温度、提取时间对鞣花酸得率的影响,确定了料液比是影响树莓中鞣花酸提取的主要因素。崔珊珊[11]通过对比微波辅助溶剂浸提法与盐酸水解法得到的鞣花酸提取物的抗氧化能力,发现微波辅助溶剂浸提法获得的树莓鞣花酸提取物对羟自由基、DPPH·自由基的清除能力,要显著高于传统的盐酸作为提取溶剂得到的鞣花酸。这表明微波辅助溶剂浸提法在提起过程中,更好的保护了树莓鞣花酸提取物的生物活性。
目前国内关于树莓功能性成分提取技术的研究尚处于实验室水平阶段,在实验室研究中大多利用色谱来分离纯化鞣花酸粗提液中的鞣花酸,使用色谱分离纯化鞣花酸优点是得率高、操作便捷。在工业生产中,目前对树莓的大多数功能性成还分无法实现大规模的工业提取与纯化。
在对鞣花酸的分离纯化研究中,辛秀兰等[12]以正丁醇-异丙醇-水(体积比)2∶1∶3为两项溶剂,进样量为20mL,检测波长254nm,建立一种高速逆流色谱(HSCCC)分离纯化红树莓果中鞣花酸的新方法。且在鞣花酸的分离过程中,为了达到更好的洗脱效果,使粗提物中的鞣花酸与水溶性易于分离,将传统的高效液相洗脱方式改为采用梯度洗脱的方式。实验结果表明,新的分离纯化方法取得了良好的分离效果,能够更好的分离粗提液中的鞣花酸,最终得到的鞣花酸纯度为81.6%。魏小聪等[13]在研究中利用高效液相法测定了树莓叶片和果实中鞣花酸的含量,改进了两项溶液,流动相A:磷酸∶水=0.5∶99.5;B相:乙腈∶水∶冰醋酸=49.5∶50∶0.5,在对树莓鞣花酸含量的测定实验中,该方法稳定性、重复性良好。测得果实中鞣花酸含量最高达849mg/kg,树莓鲜叶中鞣花酸含量为57mg/kg,不同部位鞣花酸含量依次为树莓果实>树莓干叶>树莓鲜叶。相较于返滴定法、分光光度法,高效液相色谱法表现出了明显的简便、快速的优点,其测试结果也更加的可靠。
鞣花酸属于多酚二内酯类化合物,含有4个羟基、2个内酯环[14],呈反式没食子酸单宁结构,是没食子酸的二聚衍生物[15]。纯鞣花酸是一种黄色针状晶体,熔点约为360℃,微溶于水、醇等。鞣花酸与不同物质反应呈现不同颜色,与三氯化铁反应呈蓝色,遇硫酸则呈现黄色。鞣花酸存在于多种植物的果实、叶片中,如树莓、草莓、蓝莓等。
李小萍[16]在对红树莓鞣花酸提取物的生物活性的研究中,通过研究鞣花酸的抗油脂氧化能力及鞣花酸的还原能力的试验,并通过树莓提取物鞣花酸对羟自由基(·OH)、DPPH·自由基的清除能力的试验,验证了树莓提取物中的鞣花酸有很强的清除自由基及抗油脂抗氧化能力,进一步验证了树莓鞣花酸提取物具有很强的抗氧化能力。一种物质所具有的还原能力的大小,影响着这种物质清除自由基能力的大小。李小萍在对树莓鞣花酸提取物还原能力的试验中选用还原铁系统作为验证对象,将维生素C的还原能力作为参照物,通过对比验证鞣花酸提取物的还原能力。通过实验发现,鞣花酸提取物与维生素C的还原能力均随着其浓度的升高而增加,同时实验数据也进一步表明,维生素C的还原能力要强于鞣花酸。当鞣花酸提取物的浓度达到1.0mg/mL时,此浓度下鞣花酸提取物的还原能力与0.5mg/mL的维生素C还原能力相当。但当两者浓度均超过5mg/mL后,两者的还原能力增大均已不太明显。通过对比实验证实了树莓中的鞣花酸提取物具有较强的还原能力,但其还原能力要弱于维生素C。在鞣花酸对油脂的抗氧化实验中表明,树莓鞣花酸提取液对油脂类有很明显的抗氧化作用,并且随着红树莓鞣花酸提取物浓度的提高,其抗氧化性能就越强。在树莓鞣花酸提取物的清除DPPH·自由基,Fenton法清除羟自由基的实验中均证实了,树莓鞣花酸提取物在体外有独特的抗氧化能力,其抗氧化能力随着鞣花酸浓度的增加而提高,但当浓度达到一定程度后其抗氧化能力增加已不明显。且在树莓鞣花酸提取物清除自由基的试验中表明,鞣花酸对DPPH·自由基的清除能力要强于清除羟自由基的能力。从保健方面综合利用考虑,鞣花酸的抗氧化能力对防衰老等功能品的开发有重要的参考价值。崔珊珊[11]对不同溶剂提取的树莓鞣花酸的抗氧化能力的研究表明,不同提取方法、提取溶剂得到的鞣花酸的抗氧化活性有显著差异。实验也在提醒我们,在提取过程中对生物活性的物质保护是研究的基础,也为后续功能性食品的开发提供了一定的研究基础。
大量的研究表明树莓中所含有的鞣花酸量居现已探明的各类可食用植物之首,树莓中鞣花酸含量约为1.5mg·100g/mf~2.0mg·100g/mf[17]。研究证实在抗肿瘤方面鞣花酸有突出的表现,对化学物质诱导的癌变及其他原因导致的癌变有明显的抑制作用,其中对结肠癌、食管癌、肺癌、舌及皮肤肿瘤、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等[18-20]有很好的抑制作用。杨洪亮等[21]用鞣花酸处理体外培养的小鼠乳腺癌细胞EMT6、人肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细L-02,研究发现鞣花酸对小鼠乳腺癌细胞、人肝癌细胞的增殖有显著的抑制作用,当IC50=5μg/mL时,剂量、时间对细胞的抑制起双重效果。在研究中发现鞣花酸特别是对肝癌、肺癌等的抑制作用更为显著[22],在进一步研究鞣花酸对癌细胞的作用机制中发现,鞣花酸抑制了肿瘤细胞DNA的合成。细胞增殖过程中,鞣花酸阻滞细胞有丝分裂的G0/G1期的转变,诱导细胞凋亡,同时不会影响正常细胞的繁殖。KUMARA D等[23]研究发现鞣花酸能够与姜黄素协同作用,共同诱导ROS的产生,使宫颈癌细胞上的P53蛋白大量积累,P53蛋白的累计诱导了癌细胞的大量凋亡。在对鞣花酸治疗癌症的应用中,V.Arulmozhi等[24]通过离子凝胶法将鞣花酸制备成一种胶囊药剂,将其用于治疗口腔癌。
辛秀兰等[25]通过鞣花酸提取物的抑菌试验研究发现,红树莓果实中鞣花酸的提取物物对大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、枯草杆菌等致病菌有较好的抑制作用,且当鞣花酸提取物浓度为8mg/mL时,其抑菌效果颇为明显,研究证实鞣花酸的抑菌效果是随着鞣花酸浓度增加而提高。同时在研究中也发现,鞣花酸提取物对米曲霉、黑曲霉、酵母菌等受试菌有抑制效果,但抑制效果相较其他受试菌作用不明显,仅在鞣花酸的浓度增加到6mg/mL或8mg/mL时,才出现直径不超过5.5mm的抑菌圈。
鞣花酸的生物活性除具有抗氧化、抗癌等活性外,还发现鞣花酸能够起到抑制黄褐斑形成的作用。鞣花酸能够通过降低或消除酪氨酸酶和过氧化氢酶的活性,从而降低或消除黑色素细胞的活性,从而起到抑制黄褐斑的形成的作用。徐冰等[26]通过研究发现,自愿受试者连续服用覆盆子提取物30天以后,其身体黄褐斑面积明显减少,颜色沉寂效果也有所下降,且在此后的跟踪研究中发现,受试者体表没有新的黄褐斑出现。
目前对树莓鞣花酸生物活性的研究多集中在抗氧化、抗肿瘤等能力,在保健和医疗等方面,树莓鞣花酸具有非常广阔的发展前景。鞣花酸的抗氧化能力强,可作为天然抗氧化剂进行开发利用;树莓果实浓缩提取物中的鞣花酸保健食品,在世界发达国家中,是畅销的抗癌保健品,而在国内有关树莓活性物质的保健品开发却还甚少,有巨大的发展前景。深入研究树莓鞣花酸的理化特性、生物活性,对树莓鞣花酸的高效开发及利用有重要意义,未来研究可以朝着扩大树莓活性成分药理作用的应用范围展开。改进鞣花酸的提取纯化技术,提高树莓鞣花酸的提取效率,使其展现出强大的生命力,为保健品的开发注入新鲜血液,促进我国树莓产业的发展。