硝基咪唑类药物分析方法及其应用研究

孙 惠，杨辛欣，张大方，李超英

（长春中医药大学，长春 130117）

硝基咪唑类药物结构的共同特点是咪唑环上有硝基取代，根据咪唑环上取代基的种类和位置的不同分为不同的药物。硝基咪唑类药物具有抗厌氧菌谱广、杀菌作用强、价格较低，且疗效显著等优点，与其他抗菌药物联合应用于临床各个系统的厌氧菌与需氧菌混合感染。目前国内外已上市的硝基咪唑类药物主要有甲硝唑（metronidazole）、替硝唑（tinidazole）、奥硝唑（ornidazole）、塞克硝唑（secnidazole）等。

硝基咪唑类药物疗效可靠，不良反应较轻，如消化道不良反应，恶心、呕吐、头痛、腹痛等；长期大剂量使用此类药物不良反应发生率较高且较为严重，如变态反应、过敏性休克、泌尿系统损害等[1]。因此，严格控制硝基咪唑类药物含量对临床应用起着重要作用。目前，此类药物含量测定方法有滴定法、紫外分光光度计、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用技术、气相色谱法、气相色谱-质谱联用、化学发光法、电化学方法等方法。本文针对不同方法的优势进行论述，为硝基咪唑类药物含量测定提供技术支撑。

1 分析方法

1.1 滴定法 采用的滴定方法为中和滴定，是以指示剂颜色的变化为指标，通过已知酸碱的含量求出未知酸碱的含量。目前《中国药典》（2015年版）[2]、日本药局方（The Japanese Pharmacopoeia）（JP17）[3]及《国际 药 典》（ The International Pharmacopoeia，Seventh Edition）[4]收载甲硝唑原料药均为中和滴定法，此方法具有快速、方便等优点，但也存在误差较大，重复性低及灵敏度小等缺点，目前此方法应用于常规分析，如甲硝唑原料药的一般检查。

1.2 紫外分光光度法（UV） UV法由于仪器设备简便、成本低，准确度高及易于操作等优点，已成为药物必备的检测设备之一。施春阳等[5]采用双波长分光光度法测定氯硝唑酊中氯霉素和甲硝唑的含量，根据等吸收点法，确定氯霉素测定波长为277 nm，参比波长为352 nm；甲硝唑测定波长为309 nm，参比波长为243 nm测定氯霉素平均回收率为99.7%，甲硝唑平均回收率为98.7%。该法操作简便，准确性较好，可不经分离检测氯硝唑酊中氯霉素和甲硝唑的含量。

目前，UV法主要应用于此类药物含量、药物杂质、药物稳定性、药物释放度、药物负载行为测定及其物质结构鉴定等方面，应用最多的是用于原料药及制剂的一般含量测定。

1.3 高效液相色谱法（HPLC） HPLC法于20世纪60年代后期引入气相色谱理论而迅速发展起来，是目前常用药物检测手段，具有适用范围广、分离效率高、分析速度快和自动化程度高等优点。

李为等[6]建立HPLC法同时测定复方奥硝唑贴膜中奥硝唑和地塞米松磷酸钠含量的方法，对检测波长、流动相的种类和比例进行筛选，确定色谱条件为ODS柱，流动相为甲醇-20 mmol/L磷酸盐缓冲液，检测波长为242 nm，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃；所建立的 HPLC 法专属性强、准确度高，可同时测定复方奥硝唑贴膜中奥硝唑和地塞米松磷酸钠的含量，适用于该制剂的质量控制。

Michael Cohen-Wolkowiez等[7]建立HPLC法测定干血斑（DBS）中甲硝唑的方法，以DBS为样品采集工具的新型生物分析方法结合HPLC法形成一种适合于新生儿样品的选择性、灵敏的检测方法，首次报道甲硝唑在新生儿临床小样本中的定量方法，为新生儿药物监控提供检测手段。辛显桐等[8]研究甲硝唑经口腔给药的药代动力学，研究动物为SD大鼠，给药剂量为80 mg/kg，采用结扎大鼠食管达到口腔给药的途径；实验表明甲硝唑符合与灌胃大鼠相同剂量的甲硝唑相比所显示的动力学趋势是相似的，均符合一级吸收一室模型，但达峰浓度较灌胃给药低，证实口腔黏膜吸收也是甲硝唑吸收代谢的有效途径，此给药途径可用于甲硝唑口腔疾病。Junichi Iida等[9]测定乳腺癌患者使用甲硝唑软膏后甲硝唑血药浓度并且进行分析研究，是从药代动力学角度研究局部给药甲硝唑的安全性。实验结果表明，在该患者中的血浆浓度比正常人吸收高30倍。分析血浆浓度较高的可能是由于溃疡皮肤的角质层的皮肤屏障功能比正常皮肤吸收差，药物的侵入和转移促进了表皮附近的血管吸收，影响药物的吸收。

康现武等[10]研究甲硝唑缓释微球结肠溶胶囊在家兔体内的药代动力学，采用双交叉实验设计，分别口服结肠溶胶囊及参比制剂（原料药），对比2者的药代动力学过程。结肠溶胶囊组与对照组的Tmax分别为8.5 h和1 h，Cmax 分别为 4.617 μg/mL 和 13.499 μg/mL，实验采用HPLC方法研究甲硝唑药代动力学，且证明甲硝唑缓释微球结肠溶胶囊口服给药可以在结肠吸收，且具有缓释、结肠靶向性等作用。

目前，相比于滴定法和UV法，HPLC法测定硝基咪唑类药物含量方便，快速、准确，专属性强，结果准确可靠，适用于成分复杂的制剂含量测定、质量控制及体内药代动力学等研究。

1.4 液相色谱-质谱联用技术（LC-MS） 液质联用技术是在20世纪90年代迅速发展的检测手段，将高效液相的强分离能力与质谱高灵敏度结合，使其具备高选择性、高灵敏度和强分离性等优点，可根据质谱检测器类型的不同分为液相色谱串联四级杆质谱仪、液相色谱串联飞行时间质谱仪、液相色谱串联四级杆离子阱质谱仪和液相色谱法串联傅里叶变换离子回旋共振仪等[11]。目前应用在食品、化妆品、动物饲料及口腔卫生用品中的甲硝唑痕量测定及多成分的体内代谢规律的研究。

Stephani L.等[12]建立同时定量人血浆中甲硝唑和2-羟基甲硝唑的含量测定方法，采用灌胃给予甲硝唑片，通过亲水亲脂性平衡固相萃取有效提取血浆中有效成分，采用超高效液相色谱质谱（UPLC-MS / MS）方法测定血浆成分，实验结果表明，建立的方法具有灵敏度高和高效等优点，可以应用于健康人口服甲硝唑片的药代动力学研究。Shampa Das等[13]探究头孢他啶、阿维巴坦和甲硝唑3种成分在健康受试者中的随机药代动力学和药物相互作用研究，通过UPLC-MS测定受试者的血液与尿液进行实验，采用双交叉设计考察头孢他啶-阿维巴坦与甲硝唑合用的药物相互作用关系，根据预定的时间内曲线下面积与每对药物的最大血浆浓度的比率数据表明临床上头孢他啶-阿维巴坦联用与甲硝唑联合用药不仅药效增强，且无不良反应。

硝基咪唑类药物广泛应用于临床各个领域，但该类药具有细胞诱变性和动物致癌毒性。硝基咪唑类药物可以治疗和预防动物某些细菌或原虫疾病，但其在动物组织中残留已对食品安全构成威胁，杨成对等[14]采用液相色谱-三重四级杆质谱仪同时测定家禽肌肉组织中3种硝基咪唑类药物（甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑）残留量，实验结果表明，与其他检测方法相比，此方法具有分析物响应强、运行时间短、线性范围宽及检测限低等优势。

近年来，甲硝唑因疗效明显、价格低廉，被蜂农广泛应用于治疗和预防蜜蜂孢子虫病，但是过量的使用极易引起蜂蜜中药物残留，对人体健康产生危害。肖国军等[15]采用液质法同时测定蜂蜜中甲硝唑、氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素4种成分残留，采用固相萃取柱净化，正离子和负离子采集模式，增加其测定的准确性，实验结果表明液质法适用于蜂蜜中4种成分残留量测定，为蜂蜜的质量控制提供检测技术。

硝基咪唑类药物也是临床治疗疥疮、痤疮的处方药，但因其致癌及致突变等毒性，我国禁止将其加入化妆品中，但仍有些商家非法加入使其达到效果，因此应建立合理的硝基咪唑类药物的检测方法。张鑫鑫等[16]对祛痘化妆品中5种硝基咪唑类成分（甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑、羟基甲硝唑和1-甲基-5-硝基-2-羟甲基咪唑）进行测定，采用溶剂萃取和固相萃取柱净化相结合的方法处理样品达到减小检测误差，并对其样品处理及萃取过程进行筛选，实验证明采用液质方法测定化妆品中硝基咪唑类方法可行，达到现有国内外相关法规的样品检测要求。

总之，液质联用技术在硝基咪唑类药物质量控制、指纹图谱、结构分析及痕量分析等起着重要的作用。对评价硝基咪唑类药物制剂的质量、代谢规律、药物相互作用、安全性及非法添加使用的检出起着重要作用。

1.5 其他检测方法 目前，硝基咪唑类药品检测方法还有气相色谱法[17]、气相色谱-质谱联用[18]、化学发光法（流动注射化学发光法）[19-20]、电化学方法（铜-金属有机框架物修饰电极）[21]等检测方法，由于气相色谱法对于某些成分需要进行衍生化，不适于直接测定样品；另外电化学方法方法复杂耗时，故也应用较少。

2 展望

药代动力学是动力学原理用于药物的一门边缘和交叉学科，对阐明药物体内作用机制、药效或者药物毒性大小的基础和应用研究起着重要作用，为硝基咪唑类药物临床应用提供科学依据。目前有关硝基咪唑类药物的体内外分析方法已经取得显著进展，应用于结肠定位片、缓控释透皮给药制剂等新剂型，体内药代动力学和释药规律研究，使其用药达到高效、安全及其质量可控目的。本文针对硝基咪唑类药物各种分析检测方法及其应用的研究，为开展硝基咪唑类原料、食品、化妆品的研究与应用提供检测思路与技术。尤其是高效液相色谱技术及液质联用技术广泛应用，弥补滴定法及UV法的不足，提高检测范围、灵敏度及分离能力。而滴定法及UV法多用于硝基咪唑类原料药及其制剂的常规分析，有着操作简单、快捷等优点。因此，应该注重依据此类药物具体研究和检测目标设计选择适宜的分析方法和仪器，才能达到安全、高效、便捷、低成本的检测目的。