Foxp2 小鼠模型中发育性言语障碍的分子遗传学研究

李 慧

(北京师范大学珠海分校, 珠海 519080)

语言的生成和理解是人类特有的能力，是社会和文化不可分割的一部分。近二十年来，从分子角度对语言产生的神经机制进行了全面研究。最初的工作是发现与言语、语言或阅读相关的基因组变异和基因损伤。第1 例发现的相关基因是叉头框P2 基因(forkhead box P2, FOXP2)，它编码转录因子，其突变会导致严重的神经发育言语和语言障碍[1]。鉴定FOXP2 与其它候选基因可在分子机制层面提供至关重要的信息，而目前的挑战是确定它们编码的蛋白质如何影响支持人类言语的大脑回路。

神经生物学和认知神经科学的研究[2]发现，言语和语言技能取决于皮质和亚皮质的多套神经回路的活性。构成人类语言机能的组件(如记忆、听觉意识和运动控制等)与其它脊椎动物广泛共享，且分子生物学研究[2]发现，言语和语言相关基因也在具有习得性发声行为的其他物种中存在，且通常有着“深同源性”。因此，人类言语很可能部分建立于参与感觉运动整合和运动技能学习的祖先脑网络的基础之上，对于其他物种中FOXP2等基因的直系同源物的研究显然非常有价值。以下着重讨论基因操作小鼠模型中的相关研究及发现。

1 FOXP2 基因简介

FOXP2是研究英国一个多世代家族(KE家族)所获知的第1 例参与言语和语言的基因[3]，该家族中约半数(15人)持有FOXP2杂合突变, 导致1个氨基酸被替代，从而影响了所编码蛋白质调控靶基因的能力[4]。除了包含FOXP2 基因在内的大范围染色体缺失外，与语言能力有关的多种FOXP2突变(如错义突变、无义突变和转位断点)也在各种人群中被证实过[5]。与FOXP2 基因损伤有关的一个共同特征是： 不能精确和稳定地控制流畅言语所需的运动协调性和运动顺序，被称为发育性言语运动障碍(developmental verbal dyspraxia，DVD)或儿童言语失用(childhood apraxia of speech, CAS)。患病人群所犯的言语错误每句话之间各不相同，随着话语复杂度的增加错误更加严重。除了DVD/CAS外, 其它表达性和感受性的损伤也存在,影响口头和书面语言[5]。当基因组破坏主要影响FOXP2 时, 认知的非言语部分相对不受影响[5]。对KE 家族的神经影像学研究表明，在尾状核、额下回(包括Broca区)和小脑腹侧有微小而严重的结构异常。功能磁共振成像(MRI)显示在语言任务中，KE 家族成员的皮质内核、Broca 区和罗兰迪克岛盖激活不足。这些区域与FOXP2 的高表达位点(包括皮质、基底神经节、丘脑、下橄榄体和小脑)一致[3]。以上研究显示FOXP2 影响参与言语和运动控制的脑区，言语相关的神经回路与其它运动过程相关的神经回路广泛重叠。

在所编码蛋白的序列及神经系统中的表达模式上，小鼠Foxp2 与人FOXP2 高度相似，始于胚胎期的表达一直持续到成年期[6]。目前已获得Foxp2 基因受破坏的几种小鼠系列，包括导致Foxp2蛋白缺失的突变体以及重现了在KE家族中发现的无义突变的小鼠系列[2]。完全缺乏Foxp2或只有非功能蛋白的纯合子小鼠发育迟缓或有严重的运动损伤，在3～4 周龄时死亡。相反，杂合子小鼠存活到成年期且看起来明显正常[7]。具有KE家族杂合无义突变的小鼠在超声音节的声学结构上没有变化，但所产生的序列更短，且在社交环境中不能向更复杂的句法转换，从而推断，尽管小鼠的超声发声是内源性的，但Foxp2 对发声序列的作用在小鼠与人类中是保守的[8]。

2 分子网络

对妊娠中期的胎鼠脑进行大规模的染色质免疫沉淀和表达谱分析[9], 发现了神经发育期间Foxp2所调控的基因网络, 为所影响的生物过程提供了线索。此工作鉴定出的靶基因, 突显了它们在调控神经细胞突起生长和突触可塑性的潜在作用。如今, 研究的注意力转向Foxp2 本身如何受到调控。例如一项研究[10]报道, miRNAs(miR-9和miR-32)抑制Foxp2 表达，影响神经细胞突起生长和皮质投射神经元的辐射性迁移。受Foxp2 调控的基因——接触蛋白关联蛋白样蛋白2(CNTNAP2), 与包含语言缺陷在内的神经发育障碍相关, 甚至与普通人群之间的语言发育变化相关[11]。其他Foxp2 的靶点和相互作用组也参与自闭症谱系障碍、精神分裂症、躁郁症、癫痫和智力残疾。含sushi 重复蛋白X 连锁2 基因(SRPX2)是其中一个靶基因, 它的突变将导致脑中言语相关区域的癫痫和DVD/CAS。SRPX2 抑制会损伤突触发生, 导致出生7日龄(P7)仔小鼠超声发声减少[12]。SPRX2 基因敲除初生小鼠表现超声发声个体异常和社交兴趣减少,表明SPRX2 在声音发育和社交回路中的作用[13]。在小鼠纹状体中，Foxp2 与突触抑制基因肌细胞增强子2C(Mef2c)负向互动。Mef2c 抑制皮质纹状体突触形成和树突棘形成，但本身又受到Foxp2 的抑制。Foxp2 缺失去抑制Mef2c, 纹状体内及整体性Mef2c 减少则可挽救由Foxp2 缺失突变带来的发声和纹状体树突棘的缺陷。因此Foxp2-Mef2C信号通路对皮质-纹状体回路的形成非常关键，人体中这一信号通路的缺陷可能促成一系列的神经精神障碍[14]。脑皮层中Foxp2 纯合突变导致淀粉样βA4 前体蛋白结合家族A 成员2(Apba2)表达下调, 该基因参与小鼠的趋向行为以及人类的自闭症谱系障碍[15]。这些数据共同暗示了跨越诊断界线的共同的分子和神经回路机制。然而仍不清楚靶点的调控具有细胞类型特异性还是脑区域特异性, 且尚不明确靶点的异常调控对整个生物体有什么影响。

3 Foxp2 基因与感觉处理

Foxp2 在参与感觉处理和整合的皮质和亚皮质区中表达。嗅觉系统中, 其表达发生在嗅球小球层、附属嗅球和嗅结节。Foxp2 也在丘脑躯体感受区及上行的听觉和视觉中继核团中表达。皮质区内, Foxp2 在VI 层表达广泛, 在V层的表达则主要局限于联合区和运动前区[6]。迄今为止所做工作主要集中于听觉系统。小鼠中Foxp2 在丘脑内侧膝体核的表达与听觉体验相关。Kurt 等[16]发现，Foxp2-R552H杂合子(与KE家族突变相同)比起对照组来说有更长潜伏期和更小振幅的听觉脑干反应(ABRs)，ABRs 能反映激活神经元数量或同步性的变化。然而Foxp2-S321X 杂合子(有一半剂量的功能FOXP2蛋白质)的ABRs与野生型幼仔没有显著差异。Foxp2-R552H 和Foxp2-S321X 杂合子都显示出更慢的听觉-运动联合的学习过程(由穿梭箱条件性回避实验系统评估), 然而尽管Foxp2-S321X 小鼠有正常的ABRs，它们的听觉运动学习却存在更严重的缺陷[17]。

4 Foxp2 基因与运动技能学习

Foxp2表达于与运动技能相关的皮质-纹状体和皮质-小脑回路。其中，小脑内的表达局限于浦肯野细胞和深小脑核，并在延髓的下橄榄核中强烈表达[6]。纹状体内Foxp2 的表达富集于纹状小体中[14]。且在含多巴胺受体1(DRD1)的中型多棘神经元(MSNs)中表达水平更高[18]。Foxp2 也存在于黑质致密部、腹侧被盖区和丘脑下核，可能在动机与运动输出的整合中发挥作用[6]。如上所述，Foxp2 纯合子突变体显示了更加严重的运动功能障碍和出生后致死率，而杂合子可存活，看起来大体正常。然而，对有正常运动能力的Foxp2-R552H 杂合子的分析[19]发现，它们在加速的转棒和自动转轮系统上存在学习缺陷。这些对运动技能学习和表现的影响比起人类FOXP2基因损伤的结果更为广泛，这些不同的发现可能反映了FOXP2功能的物种差异。在人类和小鼠中开发新的行为任务或者细致分析现有任务将有助于确定哪些运动技能学习特征正在受影响，例如速度、精确度或变化性。

对皮质-纹状体回路的针对性研究[20]表明，Foxp2-KO杂合子中的纹状体多巴胺水平增加而树突长度减小, Foxp2-R552H 杂合子中皮质-纹状体突触的长时程抑制(LTD)受损[19]。对在加速旋转轮上训练的Foxp2-R552H 杂合小鼠的体内电生理记录发现异常高的纹状体活性[21]。Foxp2 杂合突变体在表达DRD1的MSNs中增加了GABA受体介导的抑制型电流, 从而增加了纹状体直接通路的抑制[22]。与上述研究结果相反, Enard 等[20]发现该基因被部分人源化的Foxp2-Hum纯合子有升高的皮质-纹状体LTD，在运动技能学习中没有检测到差异。这些鼠在皮质、纹状体和丘脑中(不在小脑中)有更长的树突, 因此推测发生在人类世系中的FOXP2 中的氨基酸变化特异地影响皮质-纹状体回路。尽管Foxp2-Hum 纯合子和杂合子突变小鼠都有正常的生育能力和生命期限, 但它们的纹状体和相关的皮质基底核回路中存在显著的神经化学、神经生理学和神经解剖学变化, 这些回路是运动和认知行为所必需的[23]。Schreiweis 等[24]在Foxp2-Hum 纯合突变成年小鼠中分析纹状体三个亚区(腹侧纹状体、背外侧纹状体和背内侧纹状体)以及各亚区纹状小体和Matrix间区的Foxp2的表达，发现Foxp2 人源化突变会以区域和间区特异的方式显著影响Foxp2high(Foxp2 呈高表达水平)的神经元的分布。背侧纹状体中仅在纹状小体间区内Foxp2high神经元的密度增加了2 倍，而在腹侧纹状体中的Matrix 区间才出现了Foxp2high神经元密度增加的现象。由于纹状体不同亚区参与脑学习活动的不同阶段，纹状小体和Matrix 区间也在发育、连接性和功能方面有所不同，因此作者推测这样一种区域-间区特异的改变一定会有特定的行为效应，如实验室中显示的Foxp2 人源化会损伤小鼠纹状体依赖的吗啡行为敏感化。

Foxp2-Hum纯合突变成年小鼠的超声发声的结构和使用不受影响[25]，这与之前许多研究显示的“小鼠超声发声几乎不受发声学习的影响”的结论一致。

在小脑中，Foxp2-R552H 杂合鼠在平行纤维浦肯野细胞突触中显示了微妙的电生理变化[19]。Usui 等[26]通过体外免疫共沉淀和体内共定位实验发现初生小鼠小脑中Foxp2的类泛素化修饰调控浦肯野细胞的发育、运动功能和发声交流。然而在此领域开展了相对较少的工作。如今通过使用条件性基因敲除等策略使Foxp2区域特异性缺失变得可能, 对解释该基因在不同回路中的作用以及正确解释Foxp2 缺失后的纹状体和小脑异常很重要。

Castellucci等[27]追踪幼年到成年Foxp2杂合突变小鼠发现, 其求偶歌曲中有严重的异常, 包括发声减少、音节序列更短和节奏不规则, 说明Foxp2在幼年和成年小鼠的发声运动控制中发挥关键作用。幼年斑胸草雀的纹状体X 区中，miR-9 过度表达所伴随的FoxP2 表达下调, 会导致音节省略、歌曲模仿不精确等鸣唱损伤[28]。Adam 等[29]通过使用慢病毒载体在斑胸草雀X 区下调FoxP2 的表达，发现孤独症相关基因CNTNAP2 表达也随之减少。此外由于年龄或鸣唱原因导致的FoxP2 下调也会导致CNTNAP2 表达的下调。体外实验也证明, FoxP2 激活CNTNAP2 启动子。鸣禽中的研究证明, CNTNAP2 是FoxP2 的直接目标基因, 可能会影响与鸣曲学习和维持相关的突触功能。

5 展望

对人类、小鼠、鸣禽和其它物种中FOXP2直系同源物的研究将极大地促进对其神经功能的理解。神经细胞突起生长和突触可塑性是FOXP2靶点所深度参与的两个过程。这些研究结果已在活体内确认FOXP2缺失导致运动技能学习和感觉运动整合的缺陷以及异常的纹状体可塑性。小鼠模型是高度有效的基因操作系统, 可从分子、细胞、形态学、发育、电生理和行为等多方面研究人类病因。基因操作可能局限于特定的脑区、细胞类型或发育时间点, 而今后对行为微结构更详细的研究配以更复杂的分析方法将有助于解释微妙表型的纷繁复杂。小鼠研究的独特优势在于所能利用的遗传、分子和电生理工具的范围更广。目前有对动物遗传上确定的神经回路的神经活动进行成像和记录的技术，而且可在这些回路中利用光电子技术操作其活性。把这些技术利用于Foxp2基因损伤小鼠将充分利用该物种作为实验系统的优势, 阐明该基因对人类言语和语言的贡献。

除了研究基因功能障碍带来的语言影响，小鼠也可用来评估人类进化中潜在的表型效应。语言和直立行走等人类的基本特征, 与颅面成型与骨骼重塑等一系列解剖结构变化有关。然而人类进化中这些形态特征如何出现尚不明晰。Xu 等[30]通过分析骨骼特异的Foxp2 基因敲除小鼠，鉴定了Foxp2 在颅面成型与骨骼重塑中的作用，发现Foxp2 有助于调控后肢的力量与长度，维持关节软骨和椎间盘，这些都是适应于直立运动的解剖特征。考虑到Foxp2 在运动技能和言语相关脑回路中的作用，可推测该基因也促进言语和直立运动相关的神经结构和解剖结构的协同进化。

考虑到人类语言的复杂性以及言语和语言障碍的多样性，单种动物模型无法全面揭示其神经机制，需在呈现复杂声音行为的鸣禽和其他物种中引入更先进的遗传研究手段，例如在非人类灵长物中研究声音回路是一个迅速发展的领域。日本为期十年的脑研究计划(Brain/MINDS)专注于对狨猴的研究。Takahashi 等[31]通过对狨猴的研究发现，正常的声音发育可能受到父母反馈的影响。通过对遗传性言语障碍个体的基因扫描，已发现一系列与言语/社交/认知相关的基因(如： FOXP2,CNTNAP2, FOXP1, GNPTAB, GNPTG, NAGPA)，且在动物模型中得到研究。随着分子生物技术的不断发展，例如高通量基因分型和下一代全基因组测序技术的应用，将进一步阐明语言相关疾病(如言语失用、特殊语言障碍、发育型读写障碍)的遗传基础。