单基因病携带者筛查研究进展

庄彩霞，蒋宇林，刘俊涛

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院，北京 100730)

出生缺陷是影响人口素质的全球性问题，而单基因病是导致出生缺陷的一个重要原因。单基因病遵循孟德尔遗传定律，隐性遗传病的携带者无症状却可生育患病后代。对于严重遗传病的携带者筛查可显著降低该严重疾病患儿的流行率。本文对单基因病携带者筛查的历史和现状以及未来研究方向进行了阐述。

一、单基因病与携带者筛查

单基因遗传病是儿童畸形和残疾的主要原因之一，种类繁多。据流行病学统计，全球范围内单基因遗传疾病影响1%活产儿，占婴儿死亡率的10%以及儿科住院率的20%[1]。多数遗传性疾病没有有效的治疗方法，具有终生性治疗的特点。针对致病基因的生物技术(如转基因、RNA干扰、基因组编辑)已经成功应用于一些遗传性疾病治疗[2]。但生物技术的安全性亟待确认，且其治疗费用高造成沉重的精神和经济负担。携带有隐性致病基因突变的人，被称为“携带者”。国外一研究结果显示无表型人群中人均携带有2.8个致病突变(0～7个)[3]。美国的一项涵盖上百种基因病检测的研究[4]，研究结果表明受试者中24%至少有1种突变，5.2%受试者是多种疾病的携带者，5.4‰的夫妻携带同一致病突变。理想情况下，在孕前明确准父母的携带状态，进行充分咨询后，夫妻作出生育自主选择。携带者夫妻可选择辅助生育，如胚胎植入前遗传学诊断，或产前诊断以避免严重遗传病患儿出生[5]；或可以为患儿的出生进行充分准备，极早进行干预[6]。

二、携带者筛查的发展史

单基因病的筛查开始于1963年对新生儿进行的苯丙酮尿症筛查。新生儿筛查的最主要目的是确定新生儿期潜在致死或致残的疾病，或通过早期干预显著改善患儿生活质量和预后。但分娩后的筛查检测可能耽误部分需要尽早干预的新生儿代谢性疾病的治疗。自上世纪七八十年代，单基因遗传病携带者筛查的开展使得对某些单基因病的干预时机前移。

最初的筛查工作开展是以种族为基础进行的，20世纪70年代开展了Tay-Sachs病的携带者筛查[7]。携带者筛查的应用使Tay-Sachs病在德系犹太人群中的发病率减少超过90%[8]，明确表明了携带者筛查对降低出生缺陷的重要意义。2004年，美国妇产医师协会(ACOG)发表声明，推荐在德系犹太人后裔中进行包括Tay-Sachs病、Canavan病、囊性纤维化(CF)等四种特定疾病的携带者筛查[9]。20世纪90年代末和21世纪初，发表了关于CF的携带者筛查的建议。美国国立卫生研究院于1997年发表首次声明，建议对有CF家族史的人以及妊娠期夫妻进行携带者筛查[10]。2001年美国医学遗传基因组学会(ACMG)和ACOG发表了指南(2013年重申)，建议对北欧和德系犹太人后裔进行CF的筛查[11]。

传统携带者筛查侧重于特定种族的特定高发疾病；而随着基因技术的发展，检测成本降低，涵盖数种至百种疾病的携带者筛查panel得到了更广泛的应用。2009年开始，携带者筛查从基于种族的单个疾病筛查发展到在商业化实验室进行的无论种族的百种疾病同时筛查[12]，这种基于panel的多种疾病同时筛查的泛族裔筛查称为扩展型携带者筛查(Expanded Carrier Screening，ECS)。2011年ACOG指南(2017年更新)，推荐携带者筛查应用于育龄期人群，不局限于种族背景[13]。在过去几年，提供ECS的实验室数量和包含在panel中疾病数量持续增加。Lazarin等[4]已报道，来自美国的一项关于携带者筛查的研究应用的panel可同时检测400多种致病突变，其涵盖了108种单基因遗传病。随着分子遗传技术的发展进步，尤其是基于panel检测和高通量测序的发展，ECS应用的疾病种类已达到五百余种[14]，检测费用随着技术发展而下降。在欧洲，ECS的应用推广相对较慢，筛查的应用主要局限于疾病高发的特定种族人群和接受人工辅助生殖者[15-16]。而最近研究表明，欧洲普通人群对ECS的应用感兴趣[17-18]，并且不久的将来许多欧洲国家对ECS的需求和接受度可能会增加。目前，在美国进行ECS检测的人数每年达20万[19]，ECS的应用越来越受欢迎。

三、 携带者筛查的现状

传统的携带者筛查是基于特定的单基因遗传病家族史或基于种族背景下携带频率较高的特定疾病的筛查。在历史发展和社会变革中，基于社会结构的改变、社会人口流动、种族间通婚、收养及未知种族或种族背景复杂等变化，正确评估和确定个体的种族变得越来越困难。ACOG和ACMG推荐，以种族为基础的单病种携带者筛查模式需向泛族裔的多种疾病联合筛查(即扩展性携带者筛查，ECS)模式转化。

国外权威学术机构相继发布关于ECS的临床应用指南规范。2015年，美国遗传和生殖健康组织推荐ECS只应用于早发的严重影响健康的致残、致死的疾病，不推荐应用于成年期发病或外显率低、表达异质性高的疾病[20]。越来越多疾病的遗传和表型关联性认知度的增加使得更多的单基因遗传病被纳入到ECS的范畴内。二代测序(NGS)等分子技术的发展改变着临床基因检测的格局，ECS检测越全面，假阴性率越低，但会导致检测的假阳性率增加。由于某些变异基因临床意义不明确，建议携带者筛查应限用于目前已知基因型-表型关联明确的突变基因；在临床应用中，ECS的芯片发展需要有明确的医疗标准，而不应包括技术能检测的所有疾病[20-22]。2017年，ACOG行业指南推荐每一名孕妇都应被告知携带者筛查的实施[13，23]。携带者筛查模式同时需保持对于普通大众群体筛查检测的适用性，需要具有良好的成本-效益。随着分子技术的进步降低了携带者筛查的成本，使得多种疾病联合筛查费用不超过以往的一种特定单基因遗传病的检测费用。

国外关于携带者筛查的形势已是大势所趋，现有不少成果发表。2016年美国医学会杂志(JAMA)刊登了基于三十万余例样本的多达94种临床严重疾病的应用ECS进行相关研究[24]。同年，医学遗传学杂志(Genetics in Medicine，GIM)刊登了基于犹太人群的多种疾病联合筛查的研究[25]。2017年，澳大利亚针对3种单基因遗传病联合筛查(CF、脆性X综合征、脊髓性肌肉萎缩症)，发现受影响妊娠数量比例与唐氏综合症相当[26]。理想情况下，孕前向准父母提供携带者筛查，可以最大限度地提高携带者夫妻的生殖自主权。但由于计划外妊娠以及在孕前夫妻对携带者筛查认知的限制，妊娠期的夫妻也应该在产前被提供携带者筛查[6，22，27]。因此，为了识别无症状的生育期携带者，评估其生育风险，有效降低出生缺陷，携带者筛查的目标人群定位于妊娠或计划妊娠的夫妻[13]。产前携带者筛查并不能替代新生儿筛查，但同样不能因新生儿筛查而忽略产前筛查的价值及重要意义。携带者筛查受益的不仅仅是携带者本人，其亲属可能携带有同一致病基因，鼓励其告知亲属携带风险和携带者筛查检测的可用性，以指导生育决策，必要时进行遗传咨询，选择相应的辅助生育措施。ECS作为出生缺陷防控的有效手段已成为ACOG和ACMG等专业学会的共识。

目前，我国国内临床针对遗传性疾病筛查的咨询能力普遍不足，大众人群对携带者筛查认知度低，孕前人群优生优育观念不足，基于以上原因，国内尚无ECS的临床应用开展。

四、扩展性携带者筛查检测方法

目前在产前诊断领域应用到的遗传检测方法有多种。产前诊断最常见的核型(染色体分析)及结合荧光原位杂交(FISH)。随着分子技术的发展，PCR分子检测技术用于基因检测，例如Sanger测序[28]；测序技术的迅猛发展，NGS利用大规模平行测序，提高了基因检测的效率，降低了成本，对包括携带者筛查在内的分子检测产生重大影响[29]。目前应用的基因检测方法包括染色体微阵列分析(CMA)、NGS及靶向基因组测序和全外显子测序。CMA中的荧光标记DNA与载有数千个基因探针的panel杂交，可识别具有DNA拷贝数重复或缺失的区域。CMA目前是针对患有多种先天异常、遗传综合征以及智力和发育障碍的儿童或成人[30]。CMA引入产前诊断，作为胎儿超声异常的首选基因诊断检测[31]。对发现单基因病的新的致病突变或罕见变异或可应用全外显子测序及全基因组测序等分子检测技术。但全外显子测序应用可能导致检测出许多意义不明的变异(VUS)，对于无先证者的情况下应用于产前诊断，将为受检者带来不必要的焦虑。全外显子测序和全基因组测序等技术的应用可能同时带来诸多伦理挑战，分子技术的应用与伦理并行，更需谨慎评估与应用。

五、携带者筛查panel中纳入疾病种类以及变异位点的选择

随着分子检测技术的发展，ECS的检测panel包含疾病的数量持续增加[6]。商业实验室技术的发展之快速，可见一斑。但临床的应用上却无法跟上实验室技术进展，临床应用对检测的疾病种类需要有明确的医疗指征和标准[32]。对纳入疾病种类的选择上，需要考虑疾病的严重程度、发病年龄、患病率、携带率、成本效益以及受影响个体的治疗或其他干预方案的可用性(包括植入前或产前诊断等)。

ACOG委员会对ECS筛查疾病种类的纳入问题提出建议，包括检测病种的携带率>1/100、基因型-临床表型的明确联系以及需要临床干预[33]。ECS的目标疾病应该是严重致残致畸出生缺陷的疾病、早期发病或具有干预措施的遗传疾病[13]。但疾病症状轻、成人期发病、自然病史未知或携带率非常低的疾病，不推荐进行ECS[13]。携带者筛查病种可包括[22]：(1)常染色体隐性遗传(AR)疾病的携带者的兄弟姐妹有2/3风险携带同样的隐性致病基因。若夫妻携带同一致病基因，其后代有1/4患病的风险，选择造成严重致畸致残的出生缺陷的疾病。(2)国外指南提到可纳入极少数常染色体显性遗传(AD)疾病，可通过ECS识别AD疾病，且国外部分商业实验室的检测芯片中对AD疾病也有纳入。但疾病的外显率和表达异质性可能影响疾病的症状以及严重程度，现阶段并不一定适合纳入ECS检测范围内。(3)部分ECS也包括X连锁疾病，例如脆性X综合征和Duchenne型肌营养不良症(DMD)。由于X失活现象的存在，女性携带者可能有也可能无该疾病症状，或具有轻微症状。同时，女性携带者有50%可能生育男性患儿的风险，而子代中女性50%可能为携带者。在2017年对美国商业ECS筛查panel中包含的疾病进行的审查中，其列入筛查panel的疾病仅有27%总体上符合医疗纳入的标准[34]。

对于ECS检测目标疾病涉及到的致病突变的选择，2013年ACMG发布声明中推荐对与疾病严重性有明确临床相关性的变异位点进行检测[21]。同时，2015年ACMG、ACOG、美国围产儿保护基金会(PQF)、美国遗传咨询协会(NSGC)和美国母胎医学协会(SMFM)发布关于ECS在生殖医学中的联合声明，明确建议1)对检测的基因和变异应与表型关系明确；2)测序检出的临床意义未明变异不应报告；3)实验室检测应报告所有致病变异和疑似致病变异；4)对于等位基因频率较高、外显率低的变异不推荐进行筛查[20]。ECS检测panel中纳入疾病和变异位点，在大众人群中的发病率必须明确，在检测平台上的突变检出率必须明确，以便于评估在检测结果阴性者的残余风险[21]。对检测变异位点的选择与限制可能降低需要随访的人群数量，若检出VUS可能引起受检者不必要的焦虑，对进行遗传咨询的医师要求非常高。

六、携带者筛查临床开展将面临的困难

据NSGC、ACOG和加拿大和欧洲的遗传学会的建议，应对携带者筛查检测者进行检测前、后的咨询[20，22，35]。尤其是充分遗传咨询对于计划外妊娠夫妻或因携带者筛查认知限制的妊娠夫妻进行携带者筛查检测。但由于文化程度等的影响，临床上进行充分的遗传咨询有一定困难。若夫妻携带同一隐性致病基因者在充分遗传咨询前提下，若产前诊断还面临的流产等风险问题。另外，夫妻双方或一方为携带者时，可能影响家庭的稳定，造成医患关系紧张以及随访困难，这些隐形的伦理问题困难重重。携带者筛查检测并非由专业医疗机构提供，而更多的由商业实验室提供。商业实验室直接面向消费者，对于ECS项目的监管和责任制度迫切需要制定行业准则与标准，且商业实验室能否提供完整充分的遗传咨询令人担忧。

检测后医生需评估残余风险，即检测阴性并不能完全排除生育患儿风险的可能性[23]。原因包括：ECS检测疾病的位点通常是最常见和已知明确致病突变，检测并不涵盖该疾病的所有致病变异。如果携带频率和检出率已知的情况下，检测后残余风险可被计算出[21，36]。但某些疾病的携带频率和检出率并不能明确，造成残余风险评估不能准确量化，导致遗传咨询更大的困难。

七、携带者筛查的局限性

现行的各ECS的检测存在很大差异，其panel中最显著的差异之一是筛选出的基因数量(40～1 500个)，仅有三个基因是16个检测panel都包含的[32]。临床关于ECS的临床数据支持还有很大欠缺，需要进一步评估其临床应用。由于检测范围的局限性及基因突变的多样性，不能排除所检测基因或特定突变之外存在其他变异位点的携带，ECS阴性检测结果存在一定的残余风险。由于检测技术的原因，可能会有其他致病基因携带状态的意外结果检出，需要进行必要的遗传咨询。检测过程中可能会发现非婚生或夫妻属于近亲缘关系。隐性遗传疾病携带状态的披露，可能为受试者及家庭带来心理压力及生育压力，及其他妊娠期不必要的压力或焦虑[37]。同时，孕前和产前获得逐渐增多的遗传信息量也带来了需要慎重面对处理的道德和遗传咨询的挑战[38]。

八、携带者筛查的发展方向

未来发展中，WES及全基因组测序(WGS)可能发展为ECS的检测技术。随着医生对实验室检测的基本认识的加强，对患者提供宣教和遗传咨询非常重要。商业化实验室直接面向消费者的营销及大众媒体在促进ECS方面的影响等挑战备受关注，个人、社会、法律和伦理方面的影响值得进一步评估。

现今国内对于携带者筛查的认识不足，适合中国人群的筛查模式尚不明确，也没有相关的指南或共识指导临床应用。为构建完整的符合国情的出生缺陷防治体系，必须启动中国人群携带者筛查的研究，提出适用于中国人群的筛查模式。评估携带者筛查检测开展过程中需关注的临床咨询、检测及质控等问题，推进国内对携带者筛查检测工作的进一步认知，对提升出生入口质量、降低出生缺陷有重要意义。