樟绒枝霉α-淀粉酶在毕赤酵母中的高效表达及在麦芽糖浆制备中的作用

赵宁，王玉川，易萍，闫巧娟，江正强*

1(中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京，100083)2(中国农业大学 工学院，北京，100083)

α-淀粉酶广泛应用于食品、饲料、造纸等工业中，在整个酶制剂市场中约占25%份额[1]。微生物是α-淀粉酶的主要来源，其中产α-淀粉酶的细菌主要是芽孢杆菌属微生物[2]，真菌主要是曲霉和青霉属[3]，此外还有一些嗜热真菌产α-淀粉酶，如Scytalidiumthermophilum[4]和Thermomyceslanuginosus[5]。细菌α-淀粉酶的最适温度和最适pH分布广泛，真菌α-淀粉酶的作用条件较温和，最适温度一般在50～60 ℃，最适pH一般在5.0～6.0[3]。HAN等[6]研究了嗜热真菌樟绒枝霉(Malbrancheacinnamomea)产α-淀粉酶的产酶条件、纯化及性质，但产酶水平低，无法工业生产应用。

构建工程菌株是实现外源基因高效表达的有效途径，巴斯德毕赤酵母作为较完善的真核表达系统，目前，已有多种来源α-淀粉酶在毕赤酵母中高效表达。WANG等[7]将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶在毕赤酵母高效表达，经5 L发酵罐分批补料发酵168 h，α-淀粉酶产量为8.3 mg/mL，在 50 L发酵罐中α-淀粉酶产量为12.2 mg/mL；PARASHAR等[8]克隆来源于Bacillusacidicola和Geobacillusthermoleovorans嵌合的α-淀粉酶基因，成功表达于毕赤酵母，在7 L发酵罐中发酵，最终α-淀粉酶表达量为0.120 mg/mL，比酶活为1 180 U/mg(DNS法，每分钟反应产生1 μmol麦芽糖定义为1个酶活单位)。可以看出α-淀粉酶在毕赤酵母中高效表达具有较大应用潜力，但是目前关于嗜热真菌α-淀粉酶在毕赤酵母中表达的报道较少，仅有Rhizomucorpusillus来源α-淀粉酶。ZHANG等[9]将Rhizomucorpusillus来源α-淀粉酶和糖化酶在毕赤酵母共表达，与单一表达糖化酶相比，共表达淀粉酶的糖化活力提高了79%。

在麦芽糖浆的工业生产中，淀粉需经液化和糖化两个步骤，液化主要采用耐高温α-淀粉酶，糖化采用β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶等糖化酶。真菌α-淀粉酶作为生产麦芽糖浆的关键酶之一，已广泛应运于生产，如以大米淀粉为原料，经真菌α-淀粉酶水解制备得麦芽糖含量为45.18%的麦芽糖浆[10]。为制备高麦芽糖浆，常将α-淀粉酶与普鲁兰酶、β-淀粉酶等复配，亢潘潘[11]等将真菌α-淀粉酶与β-淀粉酶复配，制备得到麦芽糖含量为62.1%的麦芽糖浆。此外还采用色谱分离、酵母发酵等方法提高麦芽糖含量，黄伟红[12]等将色谱分离后的麦芽糖浆经活性干酵母发酵，制备得到麦芽糖含量为99%的超高麦芽糖浆。本文将嗜热真菌樟绒枝霉α-淀粉酶基因McAmyA在毕赤酵母GS115中高效表达和高密度发酵，研究重组α-淀粉酶McAmyA的酶学性质，并直接以工业化生产的液化产物为底物，研究该酶在制备麦芽糖浆中的应用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

菌株：樟绒枝霉S168由本实验室保存，大肠杆菌E.coliDH5α，购于北京博迈德生物技术有限公司，毕赤酵母GS115和质粒pPIC9K，购于美国Invitrogen公司，淀粉液化液由山东隆科特酶制剂有限公司提供(玉米淀粉为底物，细菌α-淀粉酶高温液化制得)。

液化液原液：干物质含量32%，DE值32，葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖的含量分别为(以干物质计)：1.5%、11.8%、14.1%、8.7%，残留液化酶活为150 U/mL。

1.1.2培养基

LB、YPD、MD、BMGY、BMMY等培养基的配制方法参照Invitrogen公司的《毕赤酵母表达操作手册》。

PTM1(g /L)：CuSO4·5H2O 6，NaI 0.08，MnSO4·H2O 3，Na2MoO4·2H2O 0.2，H3BO30.02，CoCl20.5，FeSO4·7 H2O 65，生物素 0.2，浓硫酸 5 mL。

1.2 方法

1.2.1 樟绒枝霉α-淀粉酶基因McAmyA的克隆和表达载体构建

根据HAN等[6]的报道，以cDNA为模板，设计引物McAmyADNAF(5′—ATGGTTTCAACAGCACTATTCCT—3′)和McAmyADNAR(5′—TCAGTTCTCGCAAAGCCCGGA—3′)，克隆樟绒枝霉α-淀粉酶基因McAmyA，然后将PCR扩增回收的DNA片段和巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K双酶切，酶切位点为SnaBI和AvrⅡ，用试剂盒回收DNA片段和表达载体pPIC9K，T4连接酶连接目的基因片段和表达载体后，转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含氨苄青霉素的LB抗性平板培养基，挑取转化子进行菌落PCR和双酶切验证，阳性转化子命名为pPIC9K-McAmyA。

1.2.2 α-淀粉酶基因McAmyA在毕赤酵母中表达

提取阳性转化子质粒，进行线性化，电转化至毕赤酵母感受态GS115，涂布于MD平板培养基，30 ℃培养4 d，待转化子长出后，将其涂布在含不同浓度遗传霉素G418的平板培养基。长出酵母后，挑取单菌落到BMGY培养基，30 ℃恒温摇床培养至OD600=2～6，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬并接种至BMMY培养基，使OD600达1.0，30 ℃恒温摇床诱导3 d，每24 h补充甲醇，使甲醇终体积分数为0.5%。

1.2.3 毕赤酵母高密度发酵

选取摇瓶发酵酶活最高的菌株，在5 L发酵罐进行高密度发酵，工作体积为1.5 L，发酵方法和发酵培养基的配制参照PichiaFermentation Guidelines (Version B，053002，Invitrogen)。发酵过程主要分为分批培养、甘油流加培养和甲醇诱导培养3个阶段。

分批培养：装1.5 L基本培养基，灭菌发酵罐，28%浓氨水调节pH至4.0，加入PTM14.35 mL/L，接种量10%，起始转速600 r/min，温度30 ℃，发酵18～24 h。

甘油流加培养：待分批培养至培养基中的甘油耗尽，流加50%甘油，28%浓氨水调节pH至5.0，流速为18.4 mL/(h·L)，流加时间4～5 h，待OD600达180～220，停止流加甘油。

甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿30 min左右，28%浓氨水调节pH至6.0，转速调为800 r/min，流加甲醇，诱导产酶，监控溶氧变化，保持DO>20%，发酵过程中取样分析菌体湿重、酶活力和蛋白含量。

1.2.4 α-淀粉酶活力及蛋白含量的测定

α-淀粉酶活力测定：采用DNS法[13]测定酶活力，将900 μL用缓冲液配置的10 g/L可溶性淀粉，于一定温度水浴锅中预热5 min后加入100 μL适当稀释的酶液，在一定温度下，水浴反应10 min，加入1 mL DNS终止反应，沸水浴10 min后测吸光值OD540，以葡萄糖作为标准品。酶活定义：每分钟反应生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位。

另外，同时采用轻工行业标准(QB 2526—2001)测定酶活，将10 mL可溶性淀粉溶液在40 ℃水浴锅中预热10 min，加入适当稀释的酶液1 mL，40 ℃准确加热30 min后，加入费林试剂4 mL使酶失活，硫代硫酸钠滴定测定生成的还原糖。酶活定义：反应30 min，反应液中产生相当于10 mg葡萄糖的还原糖所需的酶量，定义为1个淀粉糖化酶活力单位。

蛋白含量测定：参照LOWRY等的方法[14]，以牛血清蛋白(BSA)作为标准蛋白。

1.2.5 重组α-淀粉酶McAmyA的纯化

重组α-淀粉酶McAmyA经甲醇诱导168 h后，10 000 r/min 离心5 min收集上清液，用50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)在4 ℃条件下透析过夜，然后10 000 r/min离心10 min，收集上清液即为粗酶液。将粗酶液过QSFF强阴离子交换柱(50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液平衡)，流速为1.0 mL/min，用0～500 mmol/L 的NaCl溶液洗脱，收集有α-淀粉酶活性的组分，采用SDS-PAGE分析蛋白纯度。

1.2.6 最适pH和最适温度测定

最适pH的测定：选择不同pH的50 mmol/L 6种缓冲液，包括柠檬酸-柠檬酸钠(pH3.0～6.0)、醋酸-醋酸钠(pH4.0～6.0)、MES(pH5.5～7.0)、MOPS(pH6.5～8.0)、CHES(pH8.0～10.0)和CAPS(pH10.0～11.0)，配制1%可溶性淀粉底物，在65 ℃条件下，按照DNS法，测定重组α-淀粉酶McAmyA在不同缓冲体系中的酶活，测定酶活最高点设为100%。

最适温度的测定：用最适pH缓冲液配制1%可溶性淀粉底物，在40～90 ℃条件下，按照DNS法测定重组α-淀粉酶McAmyA酶活，测定酶活最高点设为100%。

1.2.7 重组α-淀粉酶McAmyA水解液化液制备麦芽糖浆

1.2.7.1 重组α-淀粉酶McAmyA加酶量对麦芽糖含量的影响

以液化液为底物，在60 ℃和自然pH(pH 5.9)下，按照液化液质量分别添加α-淀粉酶40、60、80、100、120、140、160、180 U/g，水解8 h，HPLC检测麦芽糖含量，考察重组α-淀粉酶McAmyA加酶量对麦芽糖含量的影响，并计算在最优加酶量下的水解率。

1.2.7.2 水解温度对麦芽糖含量的影响

以液化液为底物，按照120 U/g的加酶量，自然pH(pH 5.9)，水解温度分别为50、55、60、65、70、75 ℃下水解8 h，HPLC检测麦芽糖含量，考察水解温度对麦芽糖含量的影响，并计算在最佳水解温度下的水解率。

1.2.7.3 水解时间对麦芽糖含量的影响

以液化液为底物，在加酶量为120 U/g、温度60 ℃和自然pH(pH 5.9)的条件下分别水解8、10、12、14、16、20、24 h，HPLC检测麦芽糖含量，考察水解时间对麦芽糖含量的影响，并计算在最佳水解时间下的水解率。

1.2.7.4 糖含量测定和水解率计算

糖含量采用高效液相(HPLC)测定。

色谱柱：氨基键合柱(4.6×250 mm，5 μm)；检测器：ELSD 2424 蒸发光检测器；柱温：45 ℃；流动相：乙腈∶水=60∶ 40，流速1 mL/min，进样体积10 μL，糖化液过0.22 μm滤膜，稀释一定倍数备用。

水解液中各糖含量和水解率的计算如下：

(1)

(2)

干物质质量测定：阿贝折光仪直接测定(GB/T 20885—2007)。

2 结果与分析

2.1 α-淀粉酶基因McAmyA的毕赤酵母表达和高密度发酵

α-淀粉酶基因McAmyA在毕赤酵母GS115中成功表达，高拷贝筛选酶活最高的菌株进行5 L发酵罐高密度发酵，测定发酵液的酶活、蛋白含量和菌体湿重，并对发酵上清液进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示。

M-低分子质量标准蛋白；1-7分别为甲醇诱导24、48、72、96、118、144、168 h的发酵上清液图1 毕赤酵母表达重组α-淀粉酶McAmyA的高密度发酵历程(A)及SDS-PAGE(B)Fig.1 Time-course of recombinantα-amylase (McAmyA) expression in Pichia pastoris by high cell density fermention (A) and SDS-PAGE analysis of curde enzyme (B)

随甲醇诱导时间增加，菌体湿重、蛋白含量和α-淀粉酶酶活力逐渐上升(图1-A)，由SDS-PAGE可看出，目标蛋白条带随发酵时间增加逐渐变粗(图1-B)。甲醇诱导168 h时，菌体湿重为470 g/L，胞外酶活力达13 440 U/mL(QB 2526—2001法测定酶活为：253.6 U/mL)，蛋白含量为13.2 mg/mL，酶活力相比最初摇瓶发酵(554 U/mL)，提高了24.3倍。

野生型樟绒枝霉菌株产α-淀粉酶活力低(308.5 U/mL)，α-淀粉酶基因McAmyA在毕赤酵母GS115中成功表达，进行高密度发酵后，相对于原始菌株发酵，酶活提高了43.6 倍。已报道毕赤酵母表达中α-淀粉酶的表达水平较低。米曲霉(Rhizopusoryzae)α-淀粉酶在毕赤酵母中表达，分批补料发酵140 h后，蛋白表达量为0.382 mg/mL[15]。地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶在毕赤酵母中表达，经5 L发酵罐发酵168 h，蛋白表达量为8.3 mg/mL(酶活8 100 U/mL，DNS法，每分钟水解1 mg淀粉定义为1个酶活单位)[7]。本研究中樟绒枝霉α-淀粉酶在毕赤酵母GS115中高效表达，表达量在α-淀粉酶研究中处于较高水平。

2.2 重组α-淀粉酶McAmyA的纯化

重组α-淀粉酶McAmyA的纯化表如表1所示。

表1 重组α-淀粉酶McAmyA纯化表Table 1 Purification summary of McAmyA

注：a酶活测定条件：可溶性淀粉为底物，MES缓冲液(pH 6.5)，65 ℃；b蛋白质测定采用Lowry法，以牛血清蛋白(BSA)为标准品。

发酵粗酶液经QSFF强阴离子交换柱后一步纯化得到电泳级纯酶，纯化倍数为1.2，比酶活为1 230.2 U/mg，酶活力回收率为63.5%，纯酶在SDS-PAGE上显示为单一蛋白条带(见图2)，分子质量约为55 kDa。基因序列预测该蛋白分子质量为51.9 kDa，含有1个可能的N-糖基化位点，纯酶经Endo H处理后，分子质量没有发生明显变化，说明该蛋白可能未发生糖基化。

M-低分子质量标准蛋白；1-纯酶液；2-经Endo H酶切除糖基后的蛋白图2 重组α-淀粉酶McAmyA的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE of recombinant α-amylase McAmyA

2.3 重组α-淀粉酶McAmyA的最适pH和最适温度

重组α-淀粉酶McAmyA的最适pH和最适温度见图3。α-淀粉酶McAmyA的最适pH为6.5 (图3-A)，最适反应温度为65 ℃(图3-B)，大于65 ℃，酶活降低，在90 ℃基本失活。

图3 重组α-淀粉酶McAmyA的最适pH(A)和最适温度(B)Fig.3 Optimal pH (A) and optimal temperature (B) of McAmyA

重组α-淀粉酶McAmyA与野生型樟绒枝霉α-淀粉酶的最适pH和最适温度一致，最适pH接近于Fusicoccumsp.来源的α-淀粉酶[16](pH 7.0)，高于Paecilomycessp.来源的α-淀粉酶[17](pH 4.0)。最适温度低于Fusicoccumsp.[16]来源的α-淀粉酶(70 ℃)，高于Geomycespannorum来源的α-淀粉酶[18](40 ℃)。

2.4 重组α-淀粉酶McAmyA制备麦芽糖浆

2.4.1 重组α-淀粉酶McAmyA加酶量对麦芽糖含量的影响

工业生产中，淀粉液化后直接进入糖化阶段，因此选用液化液为底物，在温度60 ℃和自然pH的条件下水解8 h，重组α-淀粉酶McAmyA加酶量对麦芽糖含量的影响如图4所示。

图4 重组α-淀粉酶McAmyA加酶量对麦芽糖含量的影响Fig.4 Effect of recombinant α-amylase McAmyA dosage on maltose content

加酶量小于120 U/g时，随加酶量增加，麦芽糖含量明显增加，加酶量大于120 U/g后，麦芽糖含量增加缓慢，同时考虑生产成本和糖化效率，选择120 U/g为最适加酶量，此时的麦芽糖含量为44.3%，葡萄糖含量为14.4%(质量分数)，水解率为54.6%。

2.4.2 水解温度对麦芽糖含量的影响

以液化液为底物，在加酶量120 U/g，水解8 h的条件下，水解温度对麦芽糖含量的影响见图5。

图5 水解温度对麦芽糖含量的影响Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on maltose content

温度小于60 ℃时，随温度升高，麦芽糖含量增加，糖化温度60 ℃时，麦芽糖含量达到最大，最大为43.3%，葡萄糖含量为15.7%，此时水解率为54.9%，温度大于60 ℃后，酶活稳定性差，水解率降低，麦芽糖含量减少。

2.4.3 水解时间对麦芽糖含量的影响

以液化液为底物，在加酶量120 U/g和水解温度60 ℃的条件下，水解时间对麦芽糖含量的影响结果如图6所示。随水解时间增加，麦芽糖含量逐渐增加(图6-A)，水解时间大于14 h，麦芽糖含量增加缓慢，水解24 h时，主要产物是葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和少量麦芽四糖(图6-B)，麦芽糖含量为50.0%(图6-B)，葡萄糖含量为40.4%，此时的水解率为83.44%，达到GB/T 20883—2007对麦芽糖浆的要求，即麦芽糖含量≥50%。

图6 水解时间对麦芽糖含量的影响(A)和水解24 h糖化液的HPLC色谱图(B)Fig.6 Effect of time on maltose content (A) and HPLC chromatogram of maltose syrup at the optimal condition (B)

与已报道制备麦芽糖浆的研究相比，如张正文等[19]利用真菌α-淀粉酶在60 ℃和pH 5.5的条件下，水解40 h制备得麦芽糖含量为60%，葡萄糖含量为9.0%的啤酒用麦芽糖浆。易翠平等[10]以大米淀粉为原料，利用真菌淀粉酶在58 ℃下，水解10 h，制备得麦芽糖含量为45.18%，葡萄糖含量为4.75%的麦芽糖浆。郭俊珍等[20]在55 ℃下，水解44 h制备得76.8%的麦芽糖浆。重组α-淀粉酶McAmyA制备的麦芽糖浆中葡萄糖虽然含量较高，但是糖化温度较高，时间较短，在糖化过程中具有一定优势。

3 结论

将嗜热真菌樟绒枝霉α-淀粉酶基因McAmyA在毕赤酵母中高效表达，高密度发酵168 h时，蛋白表达量为13.2 mg/mL，胞外酶活力达13 440 U/mL。重组α-淀粉酶McAmyA粗酶液经强阴离子交换层析纯化得到电泳级纯酶，酶学性质研究表明，重组α-淀粉酶McAmyA的最适pH和最适温度分别为6.5 和65 ℃。以淀粉液化液为底物，在60 ℃、加酶量120 U/g和自然pH的条件下，水解24 h，重组α-淀粉酶McAmyA制备得麦芽糖含量为50.0%的麦芽糖浆。表明该酶在制备麦芽糖浆中具有很大应用潜力。