酒糟酶解液及不同效应因子对发酵产细菌纤维素的影响

2019-02-14 02:24贺富强杨慧敏曾礼兰
中国酿造 2019年1期
关键词:解液黄水酒糟

贺富强,杨慧敏,李 周,曾礼兰,胡 承*

(四川大学 生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室,四川 成都 610064)

细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)是由木葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)等微生物发酵产生的纤维素,其与木质纤维素的化学组成相同,均由D-葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键聚合而成。细菌纤维素具有高持水性、高机械强度、超精细(纳米级)、高纯度(不含有半纤维素和木质素等杂质)和良好的生物相容性及可降解性等独特性质[1]。因此,BC在各个领域受到广泛关注与应用,包括生物医学领域(用于组织工程支架、伤口敷料、人造皮肤与血管等)、食品领域、污水净化领域、造纸领域以及光学、电磁等领域[2-5]。但BC高昂的生产成本和较低的产量,极大的制约了细菌纤维素的工业化生产和应用。因此,寻找适宜、廉价的培养底物以降低生产成本且提高BC产量仍是细菌纤维素研究的重点。

近些年,国内外报道了许多利用廉价原料生产细菌纤维素的研究。这些原料大多数为工农业生产的副产物(如酒糟浸出液、黄水、油脂废弃物、各类果汁、棉花以及玉米和小麦秸秆等[6-9])。酒糟是酿酒行业产生的最大的副产物,其中含有丰富的淀粉、蛋白质、纤维素、脂肪等营养物质。若不能合理利用,不仅会对资源造成浪费,还会造成环境污染。因此,本研究将浓香型白酒丢糟酶解液按不同添加量加到HS培养基中,探究酒糟酶解液对木葡糖醋杆菌产BC的影响,以实现廉价酒糟向具有高附加值的BC的转化,并降低BC的生产成本。同时,以酶解液为对照,研究玉米浆、乙醇、MgSO4、Na2HPO4、黄水和柠檬酸分别对木葡糖醋杆菌发酵酒糟酶解液生产BC的影响,筛选具有促进作用的物质,更好地利用白酒丢糟,进一步提高BC产量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter xylinu s)G29:由本实验室筛选和保藏;酒糟:水井坊公司提供;黄水:采样于水井坊公司水井街基地窖池,4℃冰箱保存。玉米浆:鲁洲生物科技四川有限公司。

乙醇、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、柠檬酸、氢氧化钠、Na2HPO4·12H2O、琼脂、盐酸(均为分析纯或生化试剂):成都市科隆化学品有限公司;对羟基苯甲酸酰肼(p-hydroxybenzoic acid hydrazide,HBAH)(分析纯):上海麦克林生化科技有限公司;淀粉酶(酶活100 000 U/g):北京奥博星生物技术有限责任公司;纤维素酶(酶活200 000 U/g):山东隆大生物工程有限公司。

Herstin-Schramm(HS)培养基[10]:葡萄糖20 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母粉5 g/L,柠檬酸1 g/L,Na2HPO45 g/L,pH 5.8,115℃灭菌30 min。

固体培养基:HS培养基内加入20 g/L的琼脂,115℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

SQPPRACTUM224-ICN电子天平:赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;PHS-2C笔式pH计:上海康仪仪器有限公司;101型电热鼓风干燥箱、HWS-150恒温恒湿培养箱:北京中兴伟业仪器有限公司;Synergy H1全功能酶标仪:美国BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 木葡糖醋杆菌种子液的制备

将保藏于4℃冰箱的木葡糖醋杆菌接种到新的固体培养基上,在28℃的恒温培养箱内培养48 h。然后,挑取固体培养基中的单菌落转接到HS培养基中,在28℃、150 r/min条件下,摇床振荡培养24 h。

1.3.2 酒糟酶解液的制备

将酒糟与去离子水按照1∶4的体积比混合,在28℃条件下搅拌3 h后于4 000 r/min条件下离心10 min,抽滤将酒糟浸出液(还原糖含量为1.13 g/L)与酒糟滤渣分离,并于4℃保存。将酒糟滤渣放入80℃的烘箱中干燥48 h后粉碎,过60目筛,加入少许去离子水搅拌至糊状,放入高压蒸汽灭菌锅内,120 ℃预处理15 min。再按照固液比为1∶10(g∶mL)加入酒糟浸出液,以60 000 U/g纤维素的含量添加纤维素酶,在pH 4.8、55℃条件下酶解8 h,获得酶解液1(还原糖含量为9.23 g/L),冷却至室温后,以2 000 U/g淀粉的含量添加糖化酶,在pH 4.0、60℃条件下酶解3 h,反应结束后,100℃灭酶10 min,抽滤获得终酶解液(还原糖含量为21.29 g/L),并置于-20℃保存备用。

1.3.3 不同酶解液添加比例对木葡糖醋杆菌发酵产BC的影响

将酶解液按培养液总体积的0、25%、50%、75%、100%的体积比与HS培养基混合,配制50 mL酶解液-HS发酵培养基,调节pH值为5.8,装入250 mL锥形瓶中,115℃灭菌30 min。以HS培养基为对照,按10%的接种量分别接入木葡糖醋杆菌种子液,28℃条件下静置培养7 d,测定发酵终止后发酵液的还原糖含量、还原糖转换率、pH值和BC产量。

1.3.4 不同效应因子对酶解液发酵生产BC的影响

在酶解液中分别添加一定量的单一效应因子,配制成50 mL体系的发酵培养基,115℃灭菌30 min,效应因子与添加量如表1所示,以10%的接种量接入木葡糖醋杆菌种子液,28℃静置培养7 d,测定BC产量。

表1 效应因子与添加水平Table 1 Effect factors and addition levels

1.3.5 分析检测

还原糖的测定:采用对羟基苯甲酸酰肼(HBAH)法[11];总酸的测定:参考GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》;pH的测定:参考GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》。

细菌纤维素产量测定:将发酵产生的BC膜,用清水反复冲洗、浸泡至色素不再溶出,再将膜放入0.5 mol/L的NaOH溶液中,80℃浸泡2 h,以除去菌体蛋白和残留的培养基,然后置于80℃蒸馏水中反复洗涤至中性,该过程重复两次。将洗涤后的BC膜置于烘箱中80℃烘干至恒质量。BC产量及还原糖转化率计算公式如下:

1.3.6 数据分析

每组实验均进行3个平行,数据统计采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 酒糟酶解液成分分析

测定酒糟酶解液总酸、还原糖含量和pH值,结果见表2。

表2 酒糟酶解液理化指标测定结果Table 2 Determination results of physical and chemical indexes of vinasse enzymatic hydrolysate

由表2可知,酒糟酶解液中含有21.29 g/L的还原糖,与HS培养基中还原糖的含量(20 g/L)大致相同。此外,酶解液的总酸含量为13.48 g/L,含有大量的有机酸,这些成分可以作为葡糖醋杆菌发酵的能量物质,减少还原糖的消耗,更有利于BC的合成[12]。

2.2 不同酶解液添加量对发酵产BC的影响

以HS培养基为对照,不同酶解液添加量对BC产量、还原糖转换率和发酵液pH的影响结果见表3。

表3 酶解液添加量对细菌纤维素产量、还原糖转化率和发酵液p H的影响Table 3 Effect of enzymatic hydrolysate addition on bacterial cellulose yield,reducing sugar conversion and pH of fermentation broth

由表3可知,随着酶解液添加量的增加,BC产量和还原糖转化率均呈现持续上升的趋势,并在酶解液添加量为100%时,BC产量和还原糖转化率均达到最高,分别为4.84 g/L和31.54%,与对照组的BC产量(2.06 g/L)和还原糖转化率(13.48%)相比,分别提高了135.3%和134.0%。这可能是因为酶解液中含有的有机酸等物质作为能源物质,为菌体提供了生存繁殖的能量,减少了还原糖的消耗,促进还原糖转化为细菌纤维素[13]。发酵液pH值随着酶解液添加比的增加呈现先升后降的趋势,当完全由酶解液发酵产细菌纤维素时,pH值为4.64,与对照组的pH(3.60)相比,显著提高(P<0.05)。葡糖醋杆菌发酵生产细菌纤维素的最适pH值为4.0~6.0。酶解液为葡糖醋杆菌发酵产细菌纤维素提供了良好的pH条件。这是因为葡萄糖作为碳源发酵生产BC时会产生大量的葡萄糖酸,使培养基pH值降低,不利于发酵后期BC的产生[14],而酶解液中含有的有机酸不仅可以作为能源物质供菌体生长繁殖,进而促进更多的葡萄糖转化为BC,还可以为发酵液提供有效的缓冲作用,使发酵液的pH保持稳定。结果表明,酶解液可提高BC产量和还原糖转化率,并使发酵液pH稳定在利于BC合成的范围内。因此,酶解液可作为发酵培养基直接用于细菌纤维素的生产。

2.3 效应因子对酶解液发酵产BC的影响

2.3.1 玉米浆添加量对酶解液发酵产BC的影响

以不添加玉米浆的酶解液为对照,分别添加2%、4%、6%、8%和10%的玉米浆,28℃静置培养7 d,不同玉米浆添加量对BC产量的影响如图1所示。

图1 玉米浆添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.1 Effect of corn syrup addition on bacterial cellulose yield

由图1可知,随着玉米浆添加量的升高,BC产量呈现先升高后降低的趋势,当玉米浆添加量为4%时,BC产量最高,为5.91 g/L,比对照组酶解液的BC产量(4.84 g/L)提高了22.1%。这可能是因为玉米浆中含有大量的蛋白质和乳酸,不仅可以为葡糖醋杆菌的生长繁殖提供氮源,而且乳酸还可以作为碳源物质,减少菌体繁殖时还原糖的消耗,进而提高还原糖的转化率与BC的产量。同时,玉米浆具有较强的缓冲效应,有利于发酵液pH的稳定,促进BC的产生[15]。当玉米浆添加量>8%之后,BC的产量开始受到抑制,产量逐渐低于对照组。当玉米浆添加量达到10%时,BC产量已减少为4.5 g/L。可能是由于过量的玉米浆导致发酵液内不利于BC产生的物质增加,从而抑制了BC的合成[16]。因此,酶解液中玉米浆的最佳添加量为4%。

2.3.2 黄水添加量对酶解液发酵产BC的影响

以不添加黄水的酶解液为对照,分别添加5%、10%、15%、20%、25%的黄水,28℃静置培养7 d,不同黄水添加量对BC产量的影响如图2所示。

图2 黄水添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.2 Effect of yellow water addition on bacterial cellulose yield

由图2可知,细菌纤维素的产量随黄水添加量的增加,呈现先快速增加后又急速下降的趋势。当黄水添加量为10%时,BC产量达到最大为7.05 g/L,是对照组BC产量(4.99 g/L)的1.41倍。但随着黄水添加量的继续升高,BC产量开始急速下降,当黄水添加量为25%时,BC产量仅为3.33 g/L,只有对照组BC产量的66.7%。黄水是酿酒过程中产生的另一副产物,含有丰富的营养物质,其中乳酸、乙酸等物质的含量较高,它们均可以被葡糖醋杆菌利用,提高BC的产量[17]。但黄水添加量的增加也会使黄水中不利于菌体生存繁殖的物质(如糠醛)积累,从而减少BC的产量[18]。因此,黄水的最适添加量为10%。

2.3.3 硫酸镁对酶解液发酵产BC的影响

以不添加MgSO4的酶解液为对照,探究MgSO4添加量(0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L)对酶解液发酵产BC的影响。

如图3所示,随着硫酸镁添加量的增加,细菌纤维素的产量先上升后逐渐趋于平缓。当硫酸镁添加量在0~0.6 g/L范围增加时,BC产量也从4.84 g/L提高至5.51 g/L。硫酸镁的增效作用主要可能是由于Mg2+是微生物生长繁殖的重要酶激活剂,参与糖酵解、三羧酸循环等重要代谢途径。在葡糖醋杆菌的合成代谢中,Mg2+能够激活鸟苷酸环化酶,生成环状鸟苷酸,以激活纤维素合成酶的活性,从而能够有效的提高BC的产量[19]。但当硫酸镁添加量>0.6 g/L之后,BC产量趋于平缓,没有明显的提高。因此,酶解液中硫酸镁的最适添加量为0.6 g/L。

2.3.4 柠檬酸对酶解液发酵产BC的影响

以不添加柠檬酸的酶解液为对照,探究柠檬酸添加量(0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L)对酶解液发酵产BC的影响,结果见图4。

如图4所示,BC产量随柠檬酸添加量的增加,呈现先上升后略有下降的趋势。当柠檬酸添加量为1.5 g/L时,BC产量最大为6.08 g/L,与对照组酶解液的BC产量相比,提高了25.6%。随着柠檬酸添加量的继续增加,BC产量缓慢降低。在培养基内加入有机酸,主要是作为能源物质,促进菌体生长繁殖。柠檬酸可参与三羧酸循环,产生更多能量,加速菌体生长,可减少还原糖的消耗,提高还原糖的转化率,从而提高BC的产量[20]。因此,柠檬酸的最适添加量为1.5 g/L。

图4 柠檬酸添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.4 Effect of citric acid addition on bacterial cellulose yield

2.3.5 乙醇对酶解液发酵产BC的影响

以不添加乙醇的酶解液为对照,分别添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的用0.22μm过滤除菌的乙醇,28℃静置培养7 d。不同乙醇添加量对BC产量的影响如图5所示。

图5 乙醇添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.5 Effect of ethanol addition on bacterial cellulose yield

研究证明在培养基中加入少量的乙醇能够显著的提高BC产量,主要是因为乙醇不仅能够作为能源物质,在培养前期提供大量的能量,加速菌体生长繁殖,而且还可以减少不产细菌纤维素的阴性菌的产生,进而提高BC的产量[17]。由图5可知,随着乙醇添加量在0.2%~1.0%范围内的增加,BC产量呈现先增加后急剧降低的趋势,且在乙醇添加量为0.8%时,BC产量最大为5.83 g/L;乙醇添加量>0.8%之后,BC产量有所下降。因此,乙醇的最适添加量为0.8%。

2.3.6 磷酸氢二钠对酶解液发酵产BC的影响

以不添加磷酸氢二钠的酶解液为对照,探究磷酸氢二钠添加量(1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L)对酶解液发酵生产BC产量的影响,结果见图6。

如图6所示,随着Na2HPO4·12H2O添加量在1~5 g/L范围内的增加,BC产量呈现先升高后缓慢降低的趋势;当Na2HPO4·12H2O添加量为2 g/L时,BC产量最高为6.56 g/L,是对照组酶解液BC产量的1.32倍;因此,Na2HPO4·12H2O的最佳添加量为2 g/L。

图6 Na2HPO4·12H2O添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.6 Effect of Na2HPO4·12H2O addition on bacterial cellulose yield

3 结论

由于传统培养基生产细菌纤维素的低效性和高成本,因此将酒糟酶解液按不同体积比添加到HS培养基中发酵合成细菌纤维素。结果表明,酶解液完全替代HS培养基时,细菌纤维素产量最大为4.84 g/L,与HS培养基相比提高了135.3%;还原糖转化率为31.54%,比HS培养基提高了134.0%。HS培养基中加入酒糟酶解液后,可有效维持发酵液pH值的稳定。因此,酒糟酶解液可直接作为发酵培养基,用于细菌纤维素的合成。

玉米浆、黄水、MgSO4、柠檬酸、乙醇和Na2HPO4对酶解液发酵葡糖醋杆菌合成细菌纤维素均有促进作用,最适添加量分别为4%、10%、0.6 g/L、1.5 g/L、0.8%和2 g/L,细菌纤维素最大产量分别为5.91 g/L、7.05 g/L、5.51 g/L、6.08 g/L、5.83 g/L和6.56 g/L,其中黄水的增效作用最为显著,BC产量是HS培养基的3.4倍。

酒糟中含有丰富的营养物质,仅仅利用酒糟浸出液不能完全发挥出酒糟用于BC生产的潜力,而酒糟酶解液直接用于发酵生产细菌纤维素,不需添加其他营养物质也能获得较高的BC产量,并且添加另一种酿酒副产物黄水后,能够进一步的提高BC产量。这表明,酿酒过程中产生的副产物在BC低成本生产中具有极大的潜力。

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