酒糟酶解液及不同效应因子对发酵产细菌纤维素的影响

贺富强，杨慧敏，李 周，曾礼兰，胡 承*

（四川大学 生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川 成都 610064）

细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）是由木葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）等微生物发酵产生的纤维素，其与木质纤维素的化学组成相同，均由D-葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键聚合而成。细菌纤维素具有高持水性、高机械强度、超精细（纳米级）、高纯度（不含有半纤维素和木质素等杂质）和良好的生物相容性及可降解性等独特性质[1]。因此，BC在各个领域受到广泛关注与应用，包括生物医学领域（用于组织工程支架、伤口敷料、人造皮肤与血管等）、食品领域、污水净化领域、造纸领域以及光学、电磁等领域[2-5]。但BC高昂的生产成本和较低的产量，极大的制约了细菌纤维素的工业化生产和应用。因此，寻找适宜、廉价的培养底物以降低生产成本且提高BC产量仍是细菌纤维素研究的重点。

近些年，国内外报道了许多利用廉价原料生产细菌纤维素的研究。这些原料大多数为工农业生产的副产物（如酒糟浸出液、黄水、油脂废弃物、各类果汁、棉花以及玉米和小麦秸秆等[6-9]）。酒糟是酿酒行业产生的最大的副产物，其中含有丰富的淀粉、蛋白质、纤维素、脂肪等营养物质。若不能合理利用，不仅会对资源造成浪费，还会造成环境污染。因此，本研究将浓香型白酒丢糟酶解液按不同添加量加到HS培养基中，探究酒糟酶解液对木葡糖醋杆菌产BC的影响，以实现廉价酒糟向具有高附加值的BC的转化，并降低BC的生产成本。同时，以酶解液为对照，研究玉米浆、乙醇、MgSO4、Na2HPO4、黄水和柠檬酸分别对木葡糖醋杆菌发酵酒糟酶解液生产BC的影响，筛选具有促进作用的物质，更好地利用白酒丢糟，进一步提高BC产量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter xylinu s）G29：由本实验室筛选和保藏；酒糟：水井坊公司提供；黄水：采样于水井坊公司水井街基地窖池，4℃冰箱保存。玉米浆：鲁洲生物科技四川有限公司。

乙醇、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、柠檬酸、氢氧化钠、Na2HPO4·12H2O、琼脂、盐酸（均为分析纯或生化试剂）：成都市科隆化学品有限公司；对羟基苯甲酸酰肼（p-hydroxybenzoic acid hydrazide，HBAH）（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；淀粉酶（酶活100 000 U/g）：北京奥博星生物技术有限责任公司；纤维素酶（酶活200 000 U/g）：山东隆大生物工程有限公司。

Herstin-Schramm（HS）培养基[10]：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，柠檬酸1 g/L，Na2HPO45 g/L，pH 5.8，115℃灭菌30 min。

固体培养基：HS培养基内加入20 g/L的琼脂，115℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

SQPPRACTUM224-ICN电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；PHS-2C笔式pH计：上海康仪仪器有限公司；101型电热鼓风干燥箱、HWS-150恒温恒湿培养箱：北京中兴伟业仪器有限公司；Synergy H1全功能酶标仪：美国BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 木葡糖醋杆菌种子液的制备

将保藏于4℃冰箱的木葡糖醋杆菌接种到新的固体培养基上，在28℃的恒温培养箱内培养48 h。然后，挑取固体培养基中的单菌落转接到HS培养基中，在28℃、150 r/min条件下，摇床振荡培养24 h。

1.3.2 酒糟酶解液的制备

将酒糟与去离子水按照1∶4的体积比混合，在28℃条件下搅拌3 h后于4 000 r/min条件下离心10 min，抽滤将酒糟浸出液（还原糖含量为1.13 g/L）与酒糟滤渣分离，并于4℃保存。将酒糟滤渣放入80℃的烘箱中干燥48 h后粉碎，过60目筛，加入少许去离子水搅拌至糊状，放入高压蒸汽灭菌锅内，120 ℃预处理15 min。再按照固液比为1∶10（g∶mL）加入酒糟浸出液，以60 000 U/g纤维素的含量添加纤维素酶，在pH 4.8、55℃条件下酶解8 h，获得酶解液1（还原糖含量为9.23 g/L），冷却至室温后，以2 000 U/g淀粉的含量添加糖化酶，在pH 4.0、60℃条件下酶解3 h，反应结束后，100℃灭酶10 min，抽滤获得终酶解液（还原糖含量为21.29 g/L），并置于-20℃保存备用。

1.3.3 不同酶解液添加比例对木葡糖醋杆菌发酵产BC的影响

将酶解液按培养液总体积的0、25%、50%、75%、100%的体积比与HS培养基混合，配制50 mL酶解液-HS发酵培养基，调节pH值为5.8，装入250 mL锥形瓶中，115℃灭菌30 min。以HS培养基为对照，按10%的接种量分别接入木葡糖醋杆菌种子液，28℃条件下静置培养7 d，测定发酵终止后发酵液的还原糖含量、还原糖转换率、pH值和BC产量。

1.3.4 不同效应因子对酶解液发酵生产BC的影响

在酶解液中分别添加一定量的单一效应因子，配制成50 mL体系的发酵培养基，115℃灭菌30 min，效应因子与添加量如表1所示，以10%的接种量接入木葡糖醋杆菌种子液，28℃静置培养7 d，测定BC产量。

表1 效应因子与添加水平Table 1 Effect factors and addition levels

1.3.5 分析检测

还原糖的测定：采用对羟基苯甲酸酰肼（HBAH）法[11]；总酸的测定：参考GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》；pH的测定：参考GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》。

细菌纤维素产量测定：将发酵产生的BC膜，用清水反复冲洗、浸泡至色素不再溶出，再将膜放入0.5 mol/L的NaOH溶液中，80℃浸泡2 h，以除去菌体蛋白和残留的培养基，然后置于80℃蒸馏水中反复洗涤至中性，该过程重复两次。将洗涤后的BC膜置于烘箱中80℃烘干至恒质量。BC产量及还原糖转化率计算公式如下：

1.3.6 数据分析

每组实验均进行3个平行，数据统计采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 酒糟酶解液成分分析

测定酒糟酶解液总酸、还原糖含量和pH值，结果见表2。

表2 酒糟酶解液理化指标测定结果Table 2 Determination results of physical and chemical indexes of vinasse enzymatic hydrolysate

由表2可知，酒糟酶解液中含有21.29 g/L的还原糖，与HS培养基中还原糖的含量（20 g/L）大致相同。此外，酶解液的总酸含量为13.48 g/L，含有大量的有机酸，这些成分可以作为葡糖醋杆菌发酵的能量物质，减少还原糖的消耗，更有利于BC的合成[12]。

2.2 不同酶解液添加量对发酵产BC的影响

以HS培养基为对照，不同酶解液添加量对BC产量、还原糖转换率和发酵液pH的影响结果见表3。

表3 酶解液添加量对细菌纤维素产量、还原糖转化率和发酵液p H的影响Table 3 Effect of enzymatic hydrolysate addition on bacterial cellulose yield,reducing sugar conversion and pH of fermentation broth

由表3可知，随着酶解液添加量的增加，BC产量和还原糖转化率均呈现持续上升的趋势，并在酶解液添加量为100%时，BC产量和还原糖转化率均达到最高，分别为4.84 g/L和31.54%，与对照组的BC产量（2.06 g/L）和还原糖转化率（13.48%）相比，分别提高了135.3%和134.0%。这可能是因为酶解液中含有的有机酸等物质作为能源物质，为菌体提供了生存繁殖的能量，减少了还原糖的消耗，促进还原糖转化为细菌纤维素[13]。发酵液pH值随着酶解液添加比的增加呈现先升后降的趋势，当完全由酶解液发酵产细菌纤维素时，pH值为4.64，与对照组的pH（3.60）相比，显著提高（P＜0.05）。葡糖醋杆菌发酵生产细菌纤维素的最适pH值为4.0～6.0。酶解液为葡糖醋杆菌发酵产细菌纤维素提供了良好的pH条件。这是因为葡萄糖作为碳源发酵生产BC时会产生大量的葡萄糖酸，使培养基pH值降低，不利于发酵后期BC的产生[14]，而酶解液中含有的有机酸不仅可以作为能源物质供菌体生长繁殖，进而促进更多的葡萄糖转化为BC，还可以为发酵液提供有效的缓冲作用，使发酵液的pH保持稳定。结果表明，酶解液可提高BC产量和还原糖转化率，并使发酵液pH稳定在利于BC合成的范围内。因此，酶解液可作为发酵培养基直接用于细菌纤维素的生产。

2.3 效应因子对酶解液发酵产BC的影响

2.3.1 玉米浆添加量对酶解液发酵产BC的影响

以不添加玉米浆的酶解液为对照，分别添加2%、4%、6%、8%和10%的玉米浆，28℃静置培养7 d，不同玉米浆添加量对BC产量的影响如图1所示。

图1 玉米浆添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.1 Effect of corn syrup addition on bacterial cellulose yield

由图1可知，随着玉米浆添加量的升高，BC产量呈现先升高后降低的趋势，当玉米浆添加量为4%时，BC产量最高，为5.91 g/L，比对照组酶解液的BC产量（4.84 g/L）提高了22.1%。这可能是因为玉米浆中含有大量的蛋白质和乳酸，不仅可以为葡糖醋杆菌的生长繁殖提供氮源，而且乳酸还可以作为碳源物质，减少菌体繁殖时还原糖的消耗，进而提高还原糖的转化率与BC的产量。同时，玉米浆具有较强的缓冲效应，有利于发酵液pH的稳定，促进BC的产生[15]。当玉米浆添加量＞8%之后，BC的产量开始受到抑制，产量逐渐低于对照组。当玉米浆添加量达到10%时，BC产量已减少为4.5 g/L。可能是由于过量的玉米浆导致发酵液内不利于BC产生的物质增加，从而抑制了BC的合成[16]。因此，酶解液中玉米浆的最佳添加量为4%。

2.3.2 黄水添加量对酶解液发酵产BC的影响

以不添加黄水的酶解液为对照，分别添加5%、10%、15%、20%、25%的黄水，28℃静置培养7 d，不同黄水添加量对BC产量的影响如图2所示。

图2 黄水添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.2 Effect of yellow water addition on bacterial cellulose yield

由图2可知，细菌纤维素的产量随黄水添加量的增加，呈现先快速增加后又急速下降的趋势。当黄水添加量为10%时，BC产量达到最大为7.05 g/L，是对照组BC产量（4.99 g/L）的1.41倍。但随着黄水添加量的继续升高，BC产量开始急速下降，当黄水添加量为25%时，BC产量仅为3.33 g/L，只有对照组BC产量的66.7%。黄水是酿酒过程中产生的另一副产物，含有丰富的营养物质，其中乳酸、乙酸等物质的含量较高，它们均可以被葡糖醋杆菌利用，提高BC的产量[17]。但黄水添加量的增加也会使黄水中不利于菌体生存繁殖的物质（如糠醛）积累，从而减少BC的产量[18]。因此，黄水的最适添加量为10%。

2.3.3 硫酸镁对酶解液发酵产BC的影响

以不添加MgSO4的酶解液为对照，探究MgSO4添加量（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L）对酶解液发酵产BC的影响。

如图3所示，随着硫酸镁添加量的增加，细菌纤维素的产量先上升后逐渐趋于平缓。当硫酸镁添加量在0～0.6 g/L范围增加时，BC产量也从4.84 g/L提高至5.51 g/L。硫酸镁的增效作用主要可能是由于Mg2+是微生物生长繁殖的重要酶激活剂，参与糖酵解、三羧酸循环等重要代谢途径。在葡糖醋杆菌的合成代谢中，Mg2+能够激活鸟苷酸环化酶，生成环状鸟苷酸，以激活纤维素合成酶的活性，从而能够有效的提高BC的产量[19]。但当硫酸镁添加量＞0.6 g/L之后，BC产量趋于平缓，没有明显的提高。因此，酶解液中硫酸镁的最适添加量为0.6 g/L。

2.3.4 柠檬酸对酶解液发酵产BC的影响

以不添加柠檬酸的酶解液为对照，探究柠檬酸添加量（0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L）对酶解液发酵产BC的影响，结果见图4。

如图4所示，BC产量随柠檬酸添加量的增加，呈现先上升后略有下降的趋势。当柠檬酸添加量为1.5 g/L时，BC产量最大为6.08 g/L，与对照组酶解液的BC产量相比，提高了25.6%。随着柠檬酸添加量的继续增加，BC产量缓慢降低。在培养基内加入有机酸，主要是作为能源物质，促进菌体生长繁殖。柠檬酸可参与三羧酸循环，产生更多能量，加速菌体生长，可减少还原糖的消耗，提高还原糖的转化率，从而提高BC的产量[20]。因此，柠檬酸的最适添加量为1.5 g/L。

图4 柠檬酸添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.4 Effect of citric acid addition on bacterial cellulose yield

2.3.5 乙醇对酶解液发酵产BC的影响

以不添加乙醇的酶解液为对照，分别添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的用0.22μm过滤除菌的乙醇，28℃静置培养7 d。不同乙醇添加量对BC产量的影响如图5所示。

图5 乙醇添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.5 Effect of ethanol addition on bacterial cellulose yield

研究证明在培养基中加入少量的乙醇能够显著的提高BC产量，主要是因为乙醇不仅能够作为能源物质，在培养前期提供大量的能量，加速菌体生长繁殖，而且还可以减少不产细菌纤维素的阴性菌的产生，进而提高BC的产量[17]。由图5可知，随着乙醇添加量在0.2%～1.0%范围内的增加，BC产量呈现先增加后急剧降低的趋势，且在乙醇添加量为0.8%时，BC产量最大为5.83 g/L；乙醇添加量＞0.8%之后，BC产量有所下降。因此，乙醇的最适添加量为0.8%。

2.3.6 磷酸氢二钠对酶解液发酵产BC的影响

以不添加磷酸氢二钠的酶解液为对照，探究磷酸氢二钠添加量（1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L）对酶解液发酵生产BC产量的影响，结果见图6。

如图6所示，随着Na2HPO4·12H2O添加量在1～5 g/L范围内的增加，BC产量呈现先升高后缓慢降低的趋势；当Na2HPO4·12H2O添加量为2 g/L时，BC产量最高为6.56 g/L，是对照组酶解液BC产量的1.32倍；因此，Na2HPO4·12H2O的最佳添加量为2 g/L。

图6 Na2HPO4·12H2O添加量对细菌纤维素产量的影响Fig.6 Effect of Na2HPO4·12H2O addition on bacterial cellulose yield

3 结论

由于传统培养基生产细菌纤维素的低效性和高成本，因此将酒糟酶解液按不同体积比添加到HS培养基中发酵合成细菌纤维素。结果表明，酶解液完全替代HS培养基时，细菌纤维素产量最大为4.84 g/L，与HS培养基相比提高了135.3%；还原糖转化率为31.54%，比HS培养基提高了134.0%。HS培养基中加入酒糟酶解液后，可有效维持发酵液pH值的稳定。因此，酒糟酶解液可直接作为发酵培养基，用于细菌纤维素的合成。

玉米浆、黄水、MgSO4、柠檬酸、乙醇和Na2HPO4对酶解液发酵葡糖醋杆菌合成细菌纤维素均有促进作用，最适添加量分别为4%、10%、0.6 g/L、1.5 g/L、0.8%和2 g/L，细菌纤维素最大产量分别为5.91 g/L、7.05 g/L、5.51 g/L、6.08 g/L、5.83 g/L和6.56 g/L，其中黄水的增效作用最为显著，BC产量是HS培养基的3.4倍。

酒糟中含有丰富的营养物质，仅仅利用酒糟浸出液不能完全发挥出酒糟用于BC生产的潜力，而酒糟酶解液直接用于发酵生产细菌纤维素，不需添加其他营养物质也能获得较高的BC产量，并且添加另一种酿酒副产物黄水后，能够进一步的提高BC产量。这表明，酿酒过程中产生的副产物在BC低成本生产中具有极大的潜力。