茶树茎段组织培养过程中防褐化污染方法研究

吴婉婉，孙威江，陈志丹

1.福建农林大学园艺学院，350002；2.陕西果业集团有限公司汉中猕猴桃研发中心，710000；3.福建农林大学安溪茶学院，350002；4.福建省茶产业工程技术研究中心，350002；5.福建省茶产业行业技术开发基地，350002

植物组织培养自20 世纪初发展到现在，已经成功应用于农业、医药业、林业等领域并产生了巨大的经济、社会效益。污染、褐化和玻璃化[1-2]是植物组织培养中公认的三大难题。茶树是一类多酚类含量高且自身携带内生菌较多的植物，在组培过程中经常会出现外植体褐化、污染等问题。游见明[3]、张婉婷等[4]对茶树体内内生菌的动态、分布规律等做了一些研究，但关于在茶树组培过程中出现的内生菌污染的防治还未见相关报道。

本试验以福鼎大白茶嫩茎为材料，研究探讨降低茶树组织培养过程中外植体褐化和内生菌污染的几种方法。

一、材料与方法

1.材料与主要试剂、设备

试验材料：春、秋季生长带饱满腋芽的福鼎大白茶茎段。

主要试剂：95%无水乙醇、升汞（氯化汞）等。

仪器设备：电磁炉、自动高压蒸汽灭菌锅G154DS（致微厦门仪器有限责任公司）、纯水器、超净工作台（苏净安泰）、接种器具消毒器（上海稼丰园艺用品有限公司）。

2.试验方法

（1）材料预处理

将所采集的用于腋芽诱导的材料剪去叶片和上、下端较嫩和较老的部分，留中间带2～3 个腋芽的茎段，将材料置于烧杯中，先用洗衣粉水浸泡3～5 min，清洗掉表面尘土污垢（必要时用软毛刷轻刷材料表面），倒掉洗衣粉水，在烧杯蒙纱布置于自来水下冲滴1.0～1.5 h，再用蒸馏水冲洗1遍，在烧杯外喷洒酒精后置于超净工作台内（超净工作台事先进行紫外灯灭菌25 min左右），备用。

（2）外植体不同消毒方式比较试验

取经预处理的福鼎大白茶茎段于烧杯中，在超净工作台上消毒，再用消毒后的手术刀将福鼎大白茶幼嫩茎外植体切成1 cm 左右带1 个腋芽的茎段，接入培养基中进行培养，每瓶接种10个外植体，设3 次重复，14 d 后统计污染率和褐化率，记录结果。

（3）不同种类、浓度的吸附剂对福鼎大白茶外植体褐化的影响

通过在培养基中添加不同浓度的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和活性炭（AC），比较其对福鼎大白茶外植体褐化的控制效果，以不加吸附剂的培养基（CK）为对照。PVP设置100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L 3个质量浓度，AC设置50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L 3个质量浓度，每个处理设3次重复，接种14 d后统计褐化率。

（4）不同种类、浓度的抗生素对福鼎大白茶外植体污染的控制效果

在培养基中分别添加抗生素氨苄青霉素（AMP）和硫酸链霉素（L），各设4个不同浓度处理，每个处理重复3 次，以不添加抗生素的培养基（CK）为对照，观察接种后对外植体内生菌的控制效果。

二、结果与分析

1.不同消毒方式对福鼎大白茶外植体污染率和褐化率的影响

不同消毒方式下福鼎大白茶外植体污染率和褐化率结果见表1。从表中可见，B3 消毒方式能有效控制外植体的污染，但在控制褐化方面不及B1、B2；B1 处理在控制外植体褐化方面效果最好，但在控制污染方面不及B2、B3。综合污染率、褐化率两个指标来看，较为理想的外植体消毒方式为B2：75%酒精20～25 s+0.1%升汞4 min+无菌水冲洗2遍+0.1%升汞5 min+无菌水冲洗4遍。

表1 不同消毒方式处理14 d后外植体污染率和褐化率结果

2.不同种类、浓度的吸附剂对福鼎大白茶外植体褐化的影响

在培养基中添加不同种类、浓度的吸附剂，观察其对福鼎大白茶外植体褐化的影响，结果见表2。从表中可看出，与对照相比，用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或活性炭（AC）处理后，外植体褐化率都低于对照（CK），说明在培养基中添加PVP或AC都能降低外植体的褐化率，但AC对外植体褐化的控制效果优于PVP，最佳的AC质量浓度为150 mg/L。

表2 不同浓度的PVP和AC处理对外植体褐化的控制效果

3.不同浓度的氨苄青霉素和硫酸链霉素对内生菌的抑制效果

在培养基中分别添加氨苄青霉素和硫酸链霉素，以抑制外植体内生菌，结果（表3）表明，8个处理与对照间都存在显著性差异，说明在培养基中添加氨苄青霉素和硫酸链霉素对内生菌都有一定的抑制效果，能够显著降低茶树外植体的污染率，且硫酸链霉素的使用效果优于氨苄青霉素，最佳的硫酸链霉素质量浓度为150 mg/L。

表3 不同浓度的氨苄青霉素和硫酸链霉素对外植体污染率的影响

三、结论

外植体灭菌是植物组织培养中的重要环节。外植体灭菌要求做到既要少伤害外植体，又要尽可能地将组织材料表面的细菌、真菌等彻底杀死[5]。茶树是木本植物，升汞是最佳的外植体消毒剂，但它对材料的毒害性要强于其他消毒剂，因此，在使用时要根据外植体的类型、老嫩程度来选择最佳的消毒时间和消毒方式。间歇性升汞消毒法对外植体进行消毒时能够较有效降低外植体的污染率，同时因在2 次升汞消毒之间加了无菌水清洗的过程，从而减轻了一次性升汞消毒对材料的毒害作用。

茶树是多酚类含量较高的植物，在进行茶树组培过程中，由于外植体要受到切割，产生伤口，其体内原有的酶-底物的隔离被打破，一些酚类、醌类等有害物质会顺着伤口分泌到培养基中，积累到一定的量时，就会引起外植体发生褐化继而死亡。活性炭具有多孔结构和较强的吸附性，对分泌到培养基中的酚、醌等有一定的吸附作用，以减少它们在培养基中的积累，从而达到防止褐化的目的[6]。

此外，茶树体内携带有较多内生菌，组培过程中内生菌也是引起外植体污染的主要原因之一，但由内生菌引起的污染较难控制，一般的消毒剂对内生菌来说效果甚微。目前，研究人员对于组织培养过程中出现的污染问题，一般采用在培养基中加入杀菌剂[7]、抗生素[8-9]，或者在外植体类型的选择、灭菌方式等方面采取一些措施来克服此问题。

本试验结果表明，茶树外植体采用75%酒精20～25 s +0.1%升汞4 min +无菌水冲洗2 遍+0.1%升汞5 min+无菌水冲洗4遍消毒后，接入含150 mg/L 活性炭和150 mg/L 硫酸链霉素的培养基中培养，能较好地控制茶树组织培养过程中外植体的褐化和污染问题，提高茶树组织培养成功率。