凡纳滨对虾WSSV、IHHNV和CMNV多重PCR检测方法的建立

2019-02-13 01:35陈浩楠刘群王菁徐赟霞王宇吴艳辉耿绪云孙金生薛淑霞
河北渔业 2019年1期
关键词:对虾引物特异性

陈浩楠 刘群 王菁 徐赟霞 王宇 吴艳辉 耿绪云 孙金生 薛淑霞

摘 要:根据偷死野田村病毒(CMNV)的保守基因序列,设计筛选出1对特异性引物CMN279,利用已公布的凡纳滨对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV) 特异性引物WSS235和IHHN356,建立了一种同时检测WSSV、IHHNV和CMNV的多重 PCR 检测方法。收集18种病原、健康对虾组织及WSSV、IHHNV、CMNV阳性病料,开展特异性测试,该方法可以特异性扩增出WSSV、IHHNV、CMNV基因片段,健康对虾肌肉组织、其他18种病原均未扩增出任何片段,特异性强。应用克隆方法制备目的基因质粒,应用连续稀释质粒方法开展灵敏度测试,测定该方法检测灵敏度分别为WSSV 9.74 fg、IHHNV 7.65 fg、CMNV 10 fg;与已报道的多重PCR检测灵敏度相比较,检测灵敏度提高10倍。应用本研究建立的多重PCR检测方法与实验室标准检验方法同时进行22个样品检验,多重PCR检验方法的检验结果与实验室标准方法检验结果符合率为100%。上述实验结果表明:本研究建立的多重PCR检验方法具有特异性强、灵敏度高、检验时间短、检验结果准确度高的特点,可用于WSSV、IHHNV和CMNV三种病原的快速检测诊断。

關键词:多重PCR;白斑综合征病毒;传染性皮下及造血器官坏死病毒;偷死野田村病毒

白斑综合征病毒 (WSSV)和传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)是当前危害全球对虾养殖业的两种主要病原[1],其引起的对虾疾病被世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health, OIE)《水生动物卫生法典》收录,被列为需要报告的水生动物病毒性疫病。2009年,上述两种疾病被农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》列为水生生物一、二类动物疫病病原[2],并被农业部列入《水生动物疫病监测计划》,在重要养殖区域进行定时、定点监测。而偷死野田村病毒(CMNV)是导致对虾病毒性偷死病的病原,是近年来新发现的一种病毒,成为危害对虾养殖的又一个重要病原[3]。这三种病毒的存在,严重影响到对虾养殖业的健康发展,每年造成巨大的经济损失。

目前,检测对虾病毒的方法有很多种。其中,组织病理学方法和电镜技术存在耗时费力、操作繁琐的问题,实用性较差。而免疫学方法存在抗体不易获得和成本过高的问题,很难在生产中进行推广应用。随着分子生物技术的发展而出现的常规PCR检测技术,因其具有特异性强、反应迅速、灵敏度高的特点,而被广泛应用于对虾病毒检测。但是,常规PCR和RT-PCR也具有局限性,一次PCR反应只能检测一种病原。多重PCR技术的诞生刚好弥补了上述缺点,其突出特点是一次PCR反应可同时检测多种病原,在对虾病原检测中具有很高的实用价值[4]。

本研究在前人的研究基础上,以北方对虾养殖过程中的常见病毒为研究对象,依据现有序列,建立WSSV、IHHNV、CMNV 多重PCR检测技术。在常规病原检测中使用该方法,可以一次检测WSSV、IHHNV、CMNV 三种病原的携带情况,大大降低工作量,节约检测时间和检测成本,在对虾健康养殖和产业发展的生物安全监控中具有重要意义[5]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验所需的携带WSSV、IHHNV和CMNV阳性样品材料由天津市水生动物疫病预防控制中心实验室提供,样品编号分别为ZX2015-JY62、ZX2015-JY1656和ZX2015-JY1636。

TOP10感受态细胞(CB104)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN, DP209-03)、TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒(TIANGEN, DP103)、TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒均购于天根生化科技(北京)有限公司。

pMD18-T Vector (TaKaRa, D101A)购于宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 主要试剂

Ex Taq DNA 聚合酶,10×Ex Taq Buffer (Mg2+ free),MgCl2 (25 mmol/L),dNTP mixture (10 mmol/L),DL2000 DNA Marker,均购于宝生物工程(大连)有限公司。RNase-Free H2O,TRIzol Reagent,购于北京索莱宝科技有限公司。PCR引物由金唯智生物科技有限公司(北京)合成。LB培养基购于北京陆桥有限公司。

1.3 试验方法1.3.1 引物设计与合成 依据NCBI提供的偷死野田村病毒(CMNV)序列(Gene Bank NO.: KM112247),利用Primer Premier 5软件,设计筛选特异性引物CMN279。选取我单位设计的引物序列WSS235(CN 1944666A)为对虾白斑综合征病毒特异性引物。查阅OIE水生动物疾病诊断手册,选择IHHN356为传染性皮下及造血器官坏死病毒特异性引物。引物由金唯智生物科技有限公司(北京)合成,引物序列见表1。

1.3.2 核酸提取及cDNA合成 取100 mg鳃丝、肝胰腺,放入1.5 mL离心管中,用小剪刀剪碎。样品的DNA模板按照TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取,将提取后的模板-20 ℃保存备用。样品的RNA模板按照TRIzol Reagent说明书进行提取,利用随机引物,将提取的RNA反转录为cDNA,并保存于-80 ℃备用。

1.3.3 单重PCR扩增及质粒构建 参照Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa, RR01AM)说明书,配置25 μL PCR反应体系:10× Ex Taq Buffer (Mg2+ free) 2.5 μL,MgCl2 (25 mmol/L) 1.5 μL,dNTPs (10 mmol/L) 2 μL,F (20 μmol/L) 0.5 μL,R (20 μmol/L) 0.5 μL,Ex Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.125 μL,RNase-Free H2O 16.875 μL,模板1 μL。PCR程序:95 ℃预变性4 min,95 ℃变性20 s,56 ℃复性30 s,72 ℃延伸25 s,40个循环,最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保温。进行PCR扩增后,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,并观察结果。将PCR产物送往金唯智生物科技有限公司(北京)进行测序。

利用连接、转化、克隆等技术手段,获得浓度和纯度较高的含有目的基因片段的重组质粒。用TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒(TIANGEN, DP103)进行质粒提取,并使用超微量核酸测定仪(IMPLEN, P330)测定其浓度及纯度,于-80 ℃保存备用。

1.3.4 多重PCR检测方法的建立和优化 以Ex Taq DNA聚合酶提供的体系为基础,建立多重PCR反应体系和PCR反应程序。以建立的多重PCR反应体系和PCR反应程序为基础,依次进行Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Ex Taq DNA聚合酶浓度和退火温度的优化。

设计Mg2+在体系中的终浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L等六个浓度梯度,进行体系中Mg2+浓度的优化。

设计dNTPs在体系中的终浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L等六个浓度梯度,进行体系中dNTPs浓度的优化。

設计引物在体系中的终浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 μmol/L等六个浓度梯度,进行体系中引物浓度的优化。

设计Ex Taq DNA聚合酶在体系中的终浓度为0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24 U/μL等六个梯度,进行体系中Ex Taq DNA聚合酶浓度的优化。

以单重PCR反应程序为基础进行反应程序的优化,退火温度共设置6个梯度,分别为49.5、52.5、55.5、58.5、61.5和64.5 ℃。

1.3.5 多重PCR反应的特异性测试

以凡纳滨对虾基因组为模板,引物分别为对虾18S rDNA引物和多重PCR反应引物,利用优化后的体系和程序,进行基因组特异性测试。

利用目前实验室掌握的病原(寄生虫、细菌、病毒),进行该方法的特异性测试。病原主要包括:病毒性神经坏死病病毒(Viral Nervous Necrosis Virus,VNNV)、大鲵虹彩病毒(Andrias davidianus iridovirus,ADIV)、中华鳖虹彩病毒(Soft shelled turtle iridovirus,STIV)、草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus-873,GCRV-873)、鲤春病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)、传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus , IHNV)、锦鲤疱疹病毒(Koi hepesvirus,KHV)、草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus-9014,GCRV-9014)、坏鳃指环虫(Dactylogyrus vastator)、鳙指环虫(Dactylogyrus aristichthy)、小鞘指环虫(Dactylogyrus vaginulatus)、页形指环虫(Dactylogyrus lamellatus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio paraheamolyticus)、肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)、副溶血弧菌高致病性基因(PirA、PirB)等。

1.3.6 多重PCR反应的灵敏性测试 以10倍比梯度稀释的质粒(E+0~E+10)作为模板,利用优化后的体系和程序,进行灵敏性测试。测试过程中,以电泳条带明晰可辨为检测临界线,从而测试该方法的灵敏性。

1.3.7 多重PCR反应的准确性测试 随机抽取2015年实验室检验样品22个,同时进行多重PCR检测和标准方法检测,以标准方法PCR检测结果为准,对多重PCR检测结果进行比较,从而评价多重PCR检测方法的准确性。标准方法见表2。

2 结果

2.1 单重PCR扩增结果

采用合成的引物WSS235、IHHN356和CMN279,分别对相应的病毒进行扩增,将PCR产物送往金唯智生物科技有限公司(北京)进行测序。结果显示,三对引物均能扩增出相应病毒的单一目的条带(图1),测序后经比对发现,扩增序列为相应病毒的特异性目的基因。

2.2 多重PCR检测方法的确定

通过对Mg2+浓度(图2)、dNTPs浓度(图3)、引物浓度(图4)和Ex Taq DNA聚合酶浓度(图5)进行优化,得出多重PCR反应体系为:10×Ex Taq Buffer (Mg2+ free) 2.5 μL,MgCl2 (25 mmol/L) 2.0 μL,dNTPs (10 mmol/L) 2.5 μL,WSSV、IHHNV和CMNV上下游引物 (20 μmol/L) 分别1.25 μL,Ex Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 1.0 μL,RNase Free H2 O 6.5 μL,模板3.0 μL。

通过对退火温度(图6)进行优化,得到PCR反应程序:95 ℃预变性4 min,95 ℃变性20 s,61.5 ℃复性30 s,72 ℃延伸25 s,40个循环,最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保温。

2.3 多重PCR反应的特异性

以凡纳滨对虾基因组为模板,引物分别为对虾18S rDNA引物和多重PCR反应引物,利用优化后的体系和程序,进行基因组特异性测试,结果见图7。扩增结果显示,当模板为对虾基因组时,进行多重PCR反应,无扩增条带出现,说明建立的多重PCR反应不能扩增凡纳滨对虾基因组。

以20种病原的DNA或cDNA为模板进行多重PCR反应,结果见图7。电泳图显示,阳性对照在235 bp、279 bp、356 bp处出现扩增条带,且条带清晰,无拖尾,也未发现由于引物二聚体或引物错配而出现的非特异性扩增条带;同时,其他非目标病原DNA或cDNA均无扩增条带出现。由此说明该方法特异性强,引物之间无干扰。

2.4 多重PCR反应的灵敏性

多重PCR反应的灵敏性测试结果如图8所示,当稀释度为105copies/μL即模板中WSSV含量为0.974 pg、CMNV含量为1 pg、IHHNV含量为0.765 pg时,扩增效率明显减弱,目的条带变暗;当稀释度到103copies/μL及模板中WSSV含量为9.74 fg、CMNV含量为10 fg、IHHNV含量为7.65 fg时,能够清晰看到电泳条带;当稀释度到102copies/μL及模板中WSSV含量为0.974 fg、CMNV含量为1 fg、IHHNV含量为0.765 fg时,目的片段模糊。因此,本实验建立的多重PCR的检出限为103copies/μL,即模板中WSSV含量为9.74 fg、CMNV含量为10 fg、IHHNV含量为7.65 fg。

2.5 多重PCR反应的准确性测试

抽取实验室保存的检验样品22个,同时进行标准方法检测和多重PCR检测,以标准方法PCR检测结果为准,对多重PCR检测结果进行比较,从而评价多重PCR方法的准确性。对比结果统计见表3。

注:B: 空白对照;M: DL 2000Marker;+: 阳性对照;1泳道: 1010copies/μL ;2泳道: 109copies/μL;3泳道: 108copies/μL ;4泳道: 107copies/μL;5泳道: 106copies/μL ;6泳道: 105copies/μL ;7泳道: 104copies/μL ;8泳道: 103copies/μL;9泳道: 102copies/μL ;10泳道: 101copies/μL;11泳道: 100copies/μL图8 灵敏度测试结果

应用建立的多重PCR方法进行对虾样品检验,检测单一病毒的准确率为100%,检测混合病毒的准确率为100%,表明该方法准确可靠。

3 讨论

多重PCR(multiplex PCR,又称多重引物PCR或复合PCR),是在常规PCR基础上发展起来的一种DNA扩增技术,其反应原理、试剂、操作、仪器设备等与常规PCR反应相同,其突出特点是一次 PCR 反应即可同时检测、鉴别出多种病原体,在临床诊断病毒的混合感染中具有很高的实用价值[4]。该理论最早被Chamberian提出[6],到2002年该技术被用于检测凡纳滨对虾同时携带WSSV、TSV的情况[7],随后该方法在临床检验中发挥重要作用。

随着虾类病毒混合感染的情况越来越严重,在进行虾病诊断和亲虾筛选过程中,常规PCR和RT-PCR技術虽然较传统检验方法缩短了检验时间,提高了准确性,但是仍然要消耗大量的检测试剂、需要足够多的仪器设备以及完成大量的重复工作,这些问题给实验室造成了巨大的压力[5]。本研究建立的多重PCR检测方法,只需一次PCR反应,就能检测3种病毒,节约了2/3的检测成本。另外,该方法可以在8 h内同时完成凡纳滨对虾携带WSSV、IHHNV和CMNV的快速检测,较常规PCR方法节省时间5 d,大大提高了检测效率,缩短了检测周期,能够满足临床快速检测的要求,可用于凡纳滨对虾病毒混合感染的临床检测和亲虾筛选等工作。

本研究通过Primer Premier 5软件进行引物设计,并严格遵守引物设计原则,最终获得多对特异性引物;结合现有PCR条件,筛选出符合要求的特异性引物。通过上述方法获得的引物序列,具有扩增片段短、扩增效率高、特异性强等特点。这是多重PCR检测方法灵敏度高的一个重要原因,而另一个原因是DNA聚合酶的改变。Ex Taq DNA 聚合酶与r Taq DNA 聚合酶相比,具有扩增效率更高、错配率更低的特点。因此,本研究选择扩增效果更好的Ex Taq DNA 聚合酶作为多重PCR反应的催化剂,能够更好的完成多重PCR反应,保证PCR结果的准确性,从而提高了多重PCR检测方法的灵敏度。

在我国,杨冰等首次研究了养殖对虾同时携带WSSV、IHHNV的情况,并利用多重PCR技术检出两种病毒,该体系对WSSV DNA的检测灵敏度为2.6 pg,对IHHNV DNA检测灵敏度为99.25 fg[8]。吴思思等用多重PCR同时检测WSSV和TSV,其灵敏度分别为5 pg和0.5 pg。此后,很对学者开展了利用多重PCR技术检测虾类病原的研究,其灵敏度一般在0.1~10 pg范围内。而本研究建立的多重PCR检测方法,能够最低检测出WSSV 9.74 fg、CMNV 10 fg、IHHNV 7.65 fg,比其他多重PCR反应灵敏度提高10倍。

利用多重PCR检测方法与实验室现有检测方法分别对实验室样品进行检测,发现两种方法的检测结果完全一致,说明该方法的准确性高。因此,本研究建立的多重PCR检测方法,具有检验时间短、特异性强、灵敏度高、结果准确的特点。

WSSV、IHHNV和CMNV作为目前对虾养殖生产中重要的病毒病原,不仅能够单独感染养殖对虾,还能够混合感染。在对上一年度检验结果进行统计时,发现混合感染样品占样品总数的10%,这说明多种病毒混合感染的现象日趋严重。本研究建立的多重PCR检测方法具有快速、准确的特点,满足生产的需要。在亲虾筛选、苗种检疫中应用,能保证养殖者投放的虾苗安全、可靠;在养殖过程中定期检测病原携带情况,可以及早发现疾病,防止疾病的爆发流行,最大限度地减少经济损失,保证对虾健康养殖和产业发展。

参考文献:

[1] 丁东,熊云,方勇新,等.WSSV和IHHNV对虾病毒的胶体金免疫层析快速检测[J].水产养殖,2014,35(10):1-7.

[2] 农业部渔业渔政管理局,全国水产技术推广总站.水生动物防疫工作实用手册[M].北京:中国农业出版社,2015:112-113.

[3] Qingli Zhang, Qun Liu,Shang Liu,et al.A new nodavirus is associated with covert mortality disease of shrimp[J].Joumal of General Virology,2014,95:2700-2709.

[4] 吴思思,金立方,余招锋.凡纳滨对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测体系的建立[J].农业与技术,2012, 32(10):81-83.

[5] 劉飞,张宝存,张晓华,等.对虾6种病毒多重PCR检测方法的建立[J].渔业科学进展,2014, 35(1):60-67.

[6] Chamberlain ,JS,  Gibbs RA,  Ranier JE, et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification [J].Nucleic Acids Res,1988,16(23):111-141.

[7] Tsai J M,Shiar L J,Lee H H,et al.Simultaneous detection of white spot syndrome virus(WSSV) and Taura syndrome virus(TSV) by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) in Pacific white shrimp Penaeus vannamei[J]. Dis Aquat Org,50:9-12.

[8] 杨冰.对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的检测及其流行情况初步调查[D].青岛:中国海洋大学,2004.

(收稿日期:2018-10-15)

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