大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）的分离鉴定

尚琨 王斌 刘欣 高萍 曲凌云

摘 要：从患腹水病大菱鲆Scophthalmus maximus的肝脏中分离到一株优势细菌G1，经人工感染实验表明G1为引发大菱鲆腹水病的致病菌，且半致死浓度为LD50=1.21×105CFU·g-1。采用常规的生理生化鉴定方法及分子生物学方法对G1进行分析，结果表明，G1的16S rRNA基因序列与杀鱼爱德华氏菌Edwardsiella piscicida的同源性达100%，系统发育分析表明菌株G1与杀鱼爱德华氏菌分支聚为一支，结合生理生化鉴定结果确定G1为杀鱼爱德华氏菌。药敏试验表明菌株G1对头孢曲松、环丙氟哌酸、左氧氟沙星等8种抗菌药物高度敏感。

关键词：大菱鲆Scophthalmus maximus;杀鱼爱德华氏菌Edwardsiella piscicida;鉴定;药敏试验

爱德华氏菌属肠杆菌科，广泛存在于水体环境中，一定条件下可使不同重要经济鱼类致病[1-3]。2012年以前，世界公认的爱德华属有3种，分别为迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、保科爱德华氏菌（Edwardsiella Hoshinae）、鲶鱼爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）。Abayneh等人对13株鱼类迟缓爱德华分离株按照表型和遗传表征进行归类划分，其中12株重新定义为杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）[4]。研究发现，杀鱼爱德华氏菌常引起加州鲈（Micropterus salmoides）[5]、白鲑鱼（Whitefish）[6]、尖吻鲈鱼（Lates calcarifer）[7]、斑点叉尾鮰（Channel catfish）[8]等鱼类病害的发生。自2013年杀鱼爱德华氏菌从迟缓爱德华氏菌中分离出来重新归类为爱德华氏菌新种属以来，国内杀鱼爱德华氏菌引起大菱鲆Scophthalmus maximus腹水症暴发的报道较少。

2017年，青岛胶南养殖场大菱鲆腹水症暴发。本实验从患腹水症大菱鲆肝脏中分离出疑似病原菌G1，通过对菌株G1形态、生理生化特征、分子特征的研究确定其分类学地位，同时对其致病力进行初步研究，以期为后续养殖大菱鲆腹水病病原的检测和防治提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 病原菌分离

取具有典型腹水病症状的濒死大菱鲆，无菌条件下，用常规方法取濒死的病鱼的肝脏、肠道，研磨稀释后涂布于2216E培养基，30 ℃培养24 h，肉眼观察菌落形态、大小、颜色等，挑取不同形态的优势菌落，对挑选的优势菌落进行三次以上的纯化培养。纯化培养24 h，将纯培养物保藏至含有30%（V/V）甘油的2216E液体培养基中，于-80 ℃长期保存。

1.2 人工回感实验

健康大菱鲆购自青岛胶南养殖场，体长（13.4±1.0）cm，体重（31.7±1.0）g。挑选270尾健康大菱鲆暂养2周后进行人工感染实验。目标菌株接种于2216E液体培养基上，28 ℃培养24 h，用无菌生理盐水制成菌悬液，利用比浊法将菌液浓度调整为107cfu/mL。实验共分5个实验梯度 （103cfu/mL，104cfu/mL，105cfu/mL，106cfu/mL，107cfu/mL）和1个对照组（0.9%生理盐水）。每组处理15尾鱼，各设3个平行，采用腹腔注射，注射剂量为0.3 mL/尾，对照组注射等体积无菌生理盐水。实验期间换水量为总体积的1/3，连续观察7 d，每天观察并记录实验鱼的发病情况及濒死症状。采用寇氏法[9]计算菌株G1的半致死量，公式如下：

Xg为死亡率为 100%组的对数剂量，d对数组距，∑P为各组死亡率之和。

1.3 病原菌鉴定

1.3.1 生理生化特征分析 按照梅里埃API 20E生理生化鉴定说明书，将适量新鲜菌液悬液加入API 20E鉴定管中，37 ℃静置，24 h内观察生化鉴定管中变化。

1.3.2 分子生物学鉴定 将目标菌株纯化培养24 h后，挑取单菌落放入含有无菌水的PCR管中沸水浴煮沸20 min后获得模板DNA。采用16S rRNA基因通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492rrrr（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反应体系为60 μL： 10 μmol/L的正/反向引物各3 μL，DNA模板3 μL，2×Taq mix 30 μL，无菌水补至60 μL。反应条件为： 95 ℃ 预变性5 min，94 ℃变性 45 s，55 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸90 s，进行34个循环，72 ℃ 延伸10 min。所得16S rRNA扩增产物送至上海生工公司。

将目标菌株的16S rRNA基因扩增序列通过EzBio Cloud 数据库 （http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon）进行序列同源性分析。用Clustal W软件将NCBI数据库中获得的相似度较高的序列和其他种属的序列进行多序列匹配（Multiple Alignments）， 采用MEGA 6.0中的邻接法（neighbor joining method）构建系统发育树，并通过自举分析（boot strap）进行置信度检测，自举数据集为1 000次。

1.4 藥敏试验

采用药敏纸片扩散法对目标菌株进行药敏试验。取100 μL新鲜菌液涂布于2216E琼脂培养基上，用无菌镊子将药敏纸片（购于杭州微生物试剂有限公司）贴于培养基表面，恒温30 ℃培养24 h后，根据胡大胜[10]等人的方法测定抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 病癥表现与病原菌分离

患病大菱鲆表现为食欲减退，病鱼行动迟缓，摄食能力减弱;鱼体肝脏、肾脏肿大，腹部膨胀，肠道有白便，解剖后见微黄或无色的肠积液，严重时出现肠道挤出肛外，鳍部、吻部有出血点，后期内脏团萎缩使腹部凹陷（见图1）。病鱼肝脏、肠道组织器官涂布板上出现的细菌数量较多且菌落特征一致，经纯化从病鱼肝脏获得一株疑似病原菌株G1。

2.2 人工感染实验

实验组大菱鲆在注射目标菌株G1 20 h后均出现不同程度的腹水症状。高浓度组5～6 d达到死亡高峰期，对照组7 d内未见死亡。人工感染的试验结果表明，菌株G1能够诱发大菱鲆产生典型的腹水症状并导致死亡，是大菱鲆腹水病发病原。

根据半致死量实验结果，利用寇氏法计算LD50为1.21×105 CFU·g-1（见表1）。

2.3 生化鉴定结果

目标菌株G1为革兰氏阴性杆菌，在2216E琼脂培养基上的菌落特征为圆形、表面湿润光滑、边缘整齐、不透明（见图2）。

2.3.1 生化鉴定结果 生化鉴定结果表明，目标菌株G1不能发酵肌醇、山梨糖醇，鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖和甘露醇;精氨酸双水解酶、尿素酶、邻硝基苯-半乳糖苷、VP结果均为阴性，可以进行赖氨酸脱羧、鸟氨酸脱羧、葡萄糖发酵、H2S产气，生化鉴定结果见表2。

2.3.2 分子生物学鉴定 将测序获得的目标菌株G1的16S rRNA基因片段序列结果输入到EzBio Cloud 数据库中进行序列比对，发现菌株G1与杀鱼爱德华氏菌同源性为100%。利用MEGA6.0软件采用邻接法（neighbor joining method）构建系统发育树结果如图3所示，菌株G1与杀鱼爱德华氏菌聚为一支。

2.4 药敏试验

菌株G1对23种抗菌药物的药敏试验结果见表3，药敏实验表明病原菌对头孢曲松等8种抗菌药物高度敏感;对呋喃妥因等8种抗菌药物中度敏感;对复方新诺明等7种抗菌药物产生耐药性。

3 讨论

资料表明，引起我国鱼类腹水病的爱德华氏菌有鮰爱德华氏菌、迟缓爱德华氏菌[11-13]。不同爱德华氏菌引起的腹水病共同症状为鱼体腹部肿胀，肛门红肿，腹腔内有脓状或带血样腹水。但是，不同爱德华氏菌引起的腹水症状仍存在一定程度差异。例如，吴杰[11]等人报道的以鮰爱德华氏菌为病原的患病鱼体表现为眼球外凸，肝脏、脾脏和肾脏肿大并有出血点;李筠[12]和丁正峰[13]等人发现迟缓爱德华氏菌引起的患病鱼体表现为不同体表部位出血现象，后期伴有部分皮肤溃烂。本实验发现杀鱼爱德华氏菌可以致使大菱鲆患腹水病，其症状与爱德华氏菌病共同特征相似，但肠道内有白便，后期内脏团萎缩使腹部凹陷等症状与前人报道存在差异。

本实验采用API 20E肠道菌试纸鉴定条对菌株G1进行生理生化鉴定，并与Abayneh等人[4]研究的杀鱼爱德华氏菌标准菌株的生理生化鉴定结果进行对比，发现本研究分离的G1除柠檬酸盐与吲哚两个指标有所差异，其余生化指标都与杀鱼爱德华氏菌标准菌株一致，表明菌株G1具有典型的爱德华氏菌属的生化特征。杀鱼爱德华氏菌与迟缓爱德华氏菌是两个密切相关的物种，仅仅通过传统的生理生化鉴定无法准确的区分[7]。因此，需要利用16S rRNA基因对菌株G1进一步鉴定，结果显示，由16S rRNA基因建立的系统发育树与杀鱼爱德华氏菌聚类为一支。综合生理生化与分子生物学实验结果可以确定菌株G1为杀鱼爱德华氏菌。

目前，抗生素治疗仍是鱼类细菌性疾病有效的措施之一。本实验选取23种抗菌药物检测菌株G1的耐药情况，结果表明菌株G1对头孢曲松、环丙氟哌酸等8种抗菌药物高度敏感，对呋喃妥因、丁胺卡那等8种抗菌药物中度敏感，对磺胺异恶唑、复方新诺明等7种抗菌药物耐药。国内大菱鲆养殖方式多是采用开放式循环流水养殖模式S[14]，在实际养殖过程中，需要谨慎使用抗菌药物，切记勿过量使用抗菌药物，以防养殖水体中的病原菌对抗菌药物产生多重耐药性，不利于鱼类细菌性疾病的综合防控。

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