循环肿瘤细胞在非小细胞肺癌中的研究进展

田程 许新华

1 三峡大学第一临床医学院（湖北宜昌443003）；2三峡大学肿瘤研究所/宜昌市中心人民医院肿瘤科（湖北宜昌443003）

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）指自发或因诊疗操作脱离原发灶或者转移灶的具有高活力、高转移潜能，进入外周血液循环的一类肿瘤细胞［1］。有研究表明［2］，CTCs 是肿瘤转移的主要途径，也是肿瘤筛查、诊断、预后、疗效评估的重要标志物。此外，也有学者表明［2-3］，CTCs 可以反映肿瘤细胞在特定疾病阶段的异质性，CTCs的基因型和分子特征有助于分析与治疗相关的靶基因，识别具有潜在治疗意义的新靶点分子，或发现潜在治疗耐药机制［4］。目前非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）仍然是全世界发病率及病死率最高的恶性肿瘤［5］，同时也是免疫治疗及靶向治疗靶点基因最多的恶性肿瘤［6］。因此，可将CTCs作为肿瘤组织标本之外的实时样本进行生物学特性研究，为NSCLC精准个体治疗提供指导。

1 CTCs 的捕获方法研究

CTCs 检测涉及两方面的技术问题［7］，一是如何识别CTCs，二是如何从外周血中分离出来，目前在临床运用的CTCs 捕获技术大致有如下几种。

1.1 Cellsearch 系 统 根 据HAYES 等［8］、DANILA 等［9］、COHEN 等［10］的试验证实CTC 计数与乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者预后相关，揭示CTC 的潜力后，FDA 批准CellSearch 系统作为唯一用于临床检测CTCs 的技术。Cellsearch系统是一种基于磁免疫和染色的免疫细胞化学法，首先用上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesionmolecule，Ep-CAM）抗体磁珠富集CTCs，并在强力磁场下从血液中提取细胞，将分离的肿瘤细胞固定并用荧光抗体染色的角蛋白鉴定，然后用半自动四色荧光显微镜细胞检测分析仪进行分析，最后把CKs 阳性和CD45阴性的有肿瘤细胞学特征的上皮细胞被定义为CTCs［11］。由于起源于上皮细胞的绝大多数肺癌都表达EpCAM，因此可以使用CTC、CXC和Profile试剂盒，利用与铁水结合的抗EpCAM 抗体来检测CTC，这种方法优于单纯使用EpCAM抗原富集CTC的技术［12］。

ONSTENK 等［13］将黑素瘤细胞黏附分子（melanoma cell adhesion molecule，MCAM）联合EpCAM 作为细胞搜索富集标记物以提高CTC 检测率，研究显示单纯使用Ep-CAM 标记物的CTC 检出率为18%，MCAM 联合EpCAM 检测CTC 的检出率则为25%，证实在Cellsearch 系统中使用MCAM 联合EpCAM 作为富集标记提高了CTCs 的检测水平，但MCAM 阳性CTCs 在局限性或转移性恶性肿瘤治疗过程中的变化是否与临床结果相关，需要进一步研究。此外，SOLER 等［14］指出，虽然Cellsearch 系统被认为是目前较标准的检测方法，但其灵敏性仍有待提高，同时需要进一步开展临床研究以证实其在NSCLC 中的临床应用价值。

1.2 PT-PCR 检测法 PT-PCR 检测法通过检测外周血中特异mRNA 来间接检测CTCs，因为CTCs 中存在某些只表达或高表达于肿瘤细胞而不表达于正常外周血细胞的特异性mRNA，因此可以作为特异性标记物识别CTCs［15］。TEWES 等［16］及AKTAS 等［17］等研究证实利用RT-PCR 技术可高灵敏检测出CTCs 并评估转移性乳腺癌和卵巢癌的患者预后。与CellSearch 系统等利用免疫抗原的检测方法相比，PT-PCR 检测CTC 的敏感性相对较高。除了筛查CTCs，PT-PCR 法还能进一步将特异性的RNA 逆转录为cDNA，随后通过PCR 扩增，以进一步进行基因表型分析。因此PTPCR 检测法具有高特异性、定量的优点，而且需要的样本量较少，但该方法的不足之处是干扰基因过多、假阳性率高及难以保持反应的稳定性。

1.3 ISET 检测法 该方法在2000年由VONA 等［18］提 出，其利用CTCs 与正常细胞大小的差异，用8 μm 孔径的滤膜筛出预先固定的外周血后，再将循环肿瘤细胞免疫染色后进行CTCs 计数及观察分析细胞的形态特征［19］。LECHARPENTIER 等［20］采用ISET 富集CTCs，首次在非小细胞肺癌患者外周血中发现同时具有上皮和间质表型的混合CTC，进一步揭示EMT 的意义以及转移的机制。MAZZINI 等［21］通过ISET 对31 例葡萄膜黑色素瘤患者进行CTCs 检测，并在17 例患者中检测出单个CTC 或CTC 细胞簇，证实CTC 有作为葡萄膜黑色素瘤患者预后不良标志物的作用。ISET优点是它能在不破坏细胞形态的情况下分离上皮细胞，这一特性与它的高敏感性有关。因此ISET广泛适用于许多人类癌症循环肿瘤细胞的检测。但与其他方法相比，ISET 法或许会漏检部分体积较小的肿瘤细胞，需要对更多的细胞株和各种类型的肿瘤患者进一步研究以确定ISET 应用的范围及大小阈值［22］。

1.4 其他检测方法 CTCs 的数量在血液中处于极低水平，被数十亿外周血细胞所掩盖，因此CTC 检测技术需要较高的敏感性，以捕获稀少的CTC，同时也需要较高特异性，以排除血液中正常细胞［23］。检测方法必须是可重复、快速、经济、有效，并且可以进一步开展CTC 的单细胞基因表型的分析。

ZHANG 等［24］通过铁磁抗体可以筛选高表达c-MET的循环肿瘤细胞原理开发了一种快速、无创、灵敏、特异的检测MET 扩增型肿瘤细胞的方法。该方法对c-MET 高表达细胞的敏感度40%～80%，对c-MET 阴性细胞特异度100%。鉴于c-MET CTCs 与MET 扩增的相关性，c-MET CTCs 可能作为高表达cMET 的胃癌、结直肠癌和肾癌患者个体化治疗的预测生物标志物，但需要进一步研究以确定其临床可靠性。MURLIDHAR 等［25］报道了OncoBean 芯片技术，它利用不同的剪切系数使CTC 在高流率下通过不同的亲和性筛选出来，从乳腺癌、胰腺癌和肺癌患者的血液标本中检测的结果发现该技术的检测CTC 的平均效率＞80%，其潜在的临床应用价值值得进一步研究。

2 CTCs 在NSCLC 中的临床应用价值

目前临床应用的血清肿瘤学标志物以及高分辨率的影像学（增强CT、PETCT 或者MRI 等）检查无法准确的预判肺癌患者的进展、转移以及复发［26］。而CTCs 不仅可以反映NSCLC 患者手术后亚临床病灶的情况，还可以通过提取血液中的CTCs 进行基因表型分析，为个体化治疗决策提供依据［27］。

2.1 CTCs 捕获在诊断中的应用 CTCs 检测对于肺癌的早期诊断有一定优势。有研究表明，当影像学可探测的结节性病变癌症病灶直径＞1 cm时［28］，肺癌患者外周血液中已经可以检测到CTCs［29］。肺癌的诊断及分期对治疗至关重要，是提高总体生存率的关键，而精准诊断则为个体化治疗提供了基础。目前临床主要通过组织活检明确肿瘤的基因突变类型，但有研究显示，CTCs 有助于明确肺癌原发病灶的基因表型状况，有利于提高肺癌诊断的精准性［4，30］。MARCHETTI 等［31］等对EGFR 基因在晚期肺癌组织及其外周血CTCs 上表达水平分析比较，发现EGFR 基因在活检组织与CTCs 表达水平具有一致性。因此，随着近年CTCs 检测技术的不断优化，敏感度和特异性不断提高，其有望成为肺癌早期分子诊断的有益方法及技术［32］。

2.2 CTCs 检测在肺癌疗效评价中的应用 手术、化疗、靶向治疗、免疫治疗是目前肺癌主要的治疗手段，在疾病进展或出现转移复发之前能否进行有效评价是至关重要的。BAYARRI-LARA等［33］等前瞻性地分析了56 例NSCLC患者手术前和术后1 个月的CTCs 计数，术前每10 mL 外周血中平均有3.16 个CTCs，术后降低至0.66 个，且发现术后持续存在的CTCs 提示着肿瘤的早期复发（P=0.018）和较短的无进展生存期（P=0.008），反映了CTCs 评估肺癌患者术后复发风险的价值。此外，CTCs 在实时监测肿瘤耐药方向也有一定的作用。有研究发现［34-36］，当EGFR基因20号外显子（T790M）突变时，对TKIs治疗有效的肿瘤即会发生耐药，导致非小细胞肺癌患者病情进展。因此，CTCs不仅可以评估治疗效果，制定个体化的治疗方案，甚至可以动态监测肿瘤的耐药状态，进而分析肿瘤耐药机制。

2.3 CTCs 检查在肺癌靶向及免疫治疗中的应用 迄今为止在非小细胞肺癌中发现的靶点包括EGFR、BRAF、HER2、PI3K、ALK、ROS1 和MET 等［5，37］。如今，在超过50%的肺癌患者肿瘤组织中都可以检测到特定的驱动基因作为治疗的靶点，包括KRAS、EGFR 的点突变，FGFR1 高表达和ALK 重组。NI 等［38］等通过Cellsearch 系统检测了7 个肺腺癌患者的循环肿瘤细胞，并进行全基因测序，该研究结果表明，在CTCs 中检测到的单核酸变异（SNVs）都具有高度特异性，提示EGFR、PIK3CA、TP53 及RB1 等突变基因都可以通过CTCs 分析。因此，CTCs 捕获联合单细胞测序技术可以有效的评估患者的治疗效果及早期监测肿瘤耐药情况［39］，但CTCs 中的基因突变能否能代表NSCLC 原发灶及转移灶的基因表型尚需要更多数据验证。

MENG 等［40］等结合荧光原位杂交（Fish）技术检测乳腺癌患者CTCs 中Her2 致癌基因的扩增情况，他们发现通过原发性肿瘤分析确定的Her2 状态与他们的检测的CTCs 之间有不一致性。其他研究［41-42］通 过IF 和RT-PCR 分 析CTCs 及肿瘤组织上Her2 基因同样证实了这一现象。这表明最初Her2 阴性的患者可能在进展过程中发展为Her2 阳性的CTCs，同样也可能证明了肿瘤的转移伴随者基因型的变化。

目前，采用Cellsearch系统与ISETVR技术相结合的CTC分析作为非小细胞肺癌患者靶向治疗的预测性生物标志物的临床试验（如NCT02372448、NCT02827344、NCT02554448）预计在2年内可能得出结论［43］。此外，有WANG 等［44］利用晚期NSCLC 患者中CTCs 表面的PD-L1 状态，作为免疫治疗的疗效预测指标。ILIE 等［43］等利用自动免疫染色法从106 例NSCLC 患者外周血中检测CTCs，在80 例（75%）患者检测出CTCs。在71 个可评价的样本中比较肿瘤活检组织与CTCs，发现CTCs 的PD-L1 状态与肿瘤组织中的PD-L1状态一致，提示CTCs 作为一种有效的液体活检方法有评估晚期NSCLC 免疫治疗的价值。

3 结论

在过去的20年中，循环肿瘤细胞在基础研究和临床应用方面均取得了不少成果，其异质性强、标本获取简便、无创伤及可重复性等优势越来越被人们认可，且CTCs 对肺癌诊断、预后评价、个体化治疗有重要意义。如今基于CTCs 物理及生物特性的检测技术呈多样化发展，捕获CTCs 的效率越来越高，从而促进了单细胞基因测序及驱动基因相关研究，加快了CTCs 应用于临床的进程。但是，目前循环肿瘤细胞检测仍无法取代组织活检在肺癌中金标准的地位，主要是检测时机及cut off 值的判定、技术方法的规范性、CTCs 与原发肿瘤的生物学特征的一致性等诸多问题还需要更深入的研究来回答。但作为一种简便可行的液体活检技术在肺癌个体化治疗中有很好的运用价值前景。