AOM/DSS诱导小鼠结直肠癌炎癌转化模型的研究进展

褚志杰，张敬涛，马艳，曹广尚，白克运，杨培民

(1山东中医药大学，济南250355；2山东中医药大学附属医院)

结直肠癌(CRC)是消化道常见的恶性肿瘤。CRC的发病涉及正常黏膜上皮-异常隐窝灶-腺瘤-腺癌多个阶段[1]。炎症性肠病(IBD)与CRC关系密切，是CRC发病的一个重要原因，关于IBD-CRC的炎症性癌变的动态演变过程的机制是目前的研究热点。在IBD-CRC发病机制研究方面，由于肿瘤微环境在肿瘤增殖中起到核心作用，而体外模型缺少组织环境，因此采用体内模型进行研究非常必要。以往研究建立的模型主要为急性IBD模型、慢性IBD模型、CRC模型，研究内容局限于肿瘤的某一特定阶段，缺少对炎症向癌症转化阶段的观察。以诱变剂氧化偶氮甲烷(AOM)与致炎剂葡聚糖硫酸钠(DSS)联合使用建立的AOM/DSS小鼠模型，能够模拟正常黏膜→炎症→肿瘤生成的全过程，呈现急性炎症的初期阶段和较短的潜伏期；模型肿瘤位置多发于结肠远端，先以息肉状生长，其病理学特征与人类CRC相似[2]，能够反映人类由结肠炎症进展为肿瘤的发展模式。因此，AOM/DSS小鼠模型成为研究炎癌转化的主要模型。现将相关内容综述如下。

1 动物的选择

1.1 品系 不同品系的小鼠对AOM/DSS的耐受性、敏感性存在差异，其原因可能为遗传因素造成的黏膜抵抗炎性损伤能力的差异和(或)抑制炎症反应能力的差异[3]。Papanikolaou等[4]研究认为，近交系小鼠A/J和SWR/J敏感性高，经AOM反复腹腔注射后，最早可于第6周观察到肿瘤形成；AKR/J小鼠则对AOM耐药而不产生肿瘤。Suzuki等[5]报道4个近交系小鼠结直肠肿瘤发生的敏感性顺序为Balb/c>C57BL/6>C3H/HeN>DBA/2N，C3H/HeN和DBA/2N小鼠未发现腺癌。Melgar等[6]比较了Balb/c、C57BL/6两种常用品系DSS结肠炎进展的差异，使用DSS 1个周期后停药，Balb/c小鼠结肠炎症状恢复，而C57BL/6小鼠炎症反应持续，结肠炎进展为慢性期；认为与Balb/c小鼠相比，C57BL/6小鼠对DSS的耐受力降低，炎症过程持续时间长，最终由急性炎症发展为慢性结肠炎。

随着动物基因工程技术的发展，涌现出大量基因工程品系小鼠[7]，它们在天然的免疫活性结肠微环境中重现腺瘤或癌形成。基因工程小鼠被选择性地敲除/敲入表达相关细胞因子、蛋白的基因，通过AOM/DSS给药，观察其与常规小鼠的差异，为疾病发病机制的研究提供了有力的工具[8]。Balb/c、C57BL/6、ICR-1为目前常用的小鼠品系，其中C57BL/6小鼠是首先完成基因组测序的小鼠品系，常用于建立转基因小鼠模型，为许多突变基因提供遗传背景。C57BL/6小鼠用于构建基因修饰动物模型，可以保证遗传背景上的高度稳定性和实验数据的一致性，在AOM/DSS模型构建中得到广泛应用。

1.2 雌雄 动物雌雄差异对研究结果的影响尚不明确，需要进一步研究。综合分析近年发表的多项关于AOM/DSS小鼠模型制备方案的文献，结果显示，雌雄小鼠均可受到AOM/DSS诱导，生成结直肠肿瘤[9,10]。Snider等[2]综述了AOM/DSS诱导的结肠炎相关癌症小鼠模型，认为尽管雌雄两性小鼠都易受AOM/DSS诱导的CAC的影响，但根据作者的观察，雌性小鼠倾向于产生更一致和可再现的结果。在观察高脂饮食的影响时，通常选用雄性小鼠。Heijmans等[11]报道，在炎症损伤的情况下，雌激素可促进结肠炎相关肿瘤的发展。在人类中，激素替代疗法增加了绝经后妇女患溃疡性结肠炎及相关疾病的风险。Son等[9]观察了雌二醇对不同性别ICR小鼠CRC肿瘤的影响，比较了不同取样时间的结肠组织标本中低程度恶性腺瘤、高度恶性腺瘤、癌症有黏膜侵犯、癌症与黏膜下层侵袭的肿瘤数量和肿瘤发生率，发现雌性较雄性肿瘤数量减少、肿瘤发生率降低，肿瘤多样性(即指不同发展程度的结肠肿瘤的分布情况)减少；在早期炎症阶段，雌二醇干预能抑制炎症程度，减少肿瘤的发生。因此动物性别对研究的影响需要引起研究者的注意，建议根据研究目的选择和明确动物的性别。

2 用药方案

诱变剂AOM的活性代谢产物甲基氧化偶氮甲醇(MAM)通过胆汁和血液系统进入肠道，在肠道中被肠道菌群水解酶分解为甲基碳正离子从而使DNA烷基化，诱发肿瘤生成。致炎剂DSS为化学致炎剂，通过破坏肠黏膜屏障引起肠道炎症。一般认为，AOM一次给药配合DSS循环给药即可获得满意的效果。

2.1 AOM的用药方法 根据实验室、小鼠环境设施和小鼠品系的差别，AOM给药可以出现不同的效果。建议在野生型小鼠的3个不同队列中使用3种不同剂量(7.5、10、12.5 mg/kg)进行试验。AOM的病死率通常在注射后24～72 h内可观察到[12]。

2.2 DSS的用药方法

2.2.1 DSS的选择 DSS是一种硫酸化多糖，具有很宽的分子量范围(5～1 400 kDa)。不同分子量的DSS导致结肠炎和致癌的活性存在差异。5 kDa分子量的DSS处理的小鼠表现为较轻的结肠炎，在盲肠和升结肠中形成相对斑片状的病变。500 kDa分子量的DSS无法通过肠道黏膜，经其处理的小鼠在大肠中不形成病变，没有诱导致癌活性。40 kDa分子量的DSS处理的Balb/c小鼠表现为严重的结肠炎，适用于本模型研究[3]。另外DSS的来源也非常重要，不同厂家甚至不同批次的DSS可能产生显著不同的结果。因此建议在每个实验中使用同一制造商生产的同一批次。DSS溶液放置几天后可能变得浑浊，建议2～3 d更换一次。

2.2.2 DSS的浓度与给药时间 综合多项关于AOM/DSS小鼠模型制备方案的文献，各方案的DSS浓度与给药时间并不一致[1，9,10]。Perse等[3]总结认为，短期(4～9 d)连续给予2%～5% DSS可诱发急性结肠炎，临床表现为体质量减轻、腹泻、便秘潜血、竖毛、贫血，最终死亡。连续治疗低浓度DSS或周期性给予DSS可能诱发慢性结肠炎。Suzuki等[13]对ICR雄性小鼠腹腔注射AOM 10 mg/kg后，分别给予0.5%、1%、2%的DSS饮用1周，于14周时处死动物；2%浓度组小鼠结肠管状腺瘤发生率为100%(其中75%为腺癌)，1%浓度组腺瘤发生率为80%(其中60%为腺癌)，0.5%浓度组仅产生1个腺瘤；认为DSS的肿瘤促进作用呈剂量依赖性，要采用1%及以上浓度才能产生作用。

模型动物的结肠炎严重程度与DSS的负荷剂量相关。为了诱导可靠并且重复性好的结肠炎(以组织MPO的活性和组织病理变化为标准)，DSS总摄取量需要超过30 mg/g体质量的临界负荷。一旦满足该临界负荷，DSS的摄入剂量的差异不会影响炎症反应的严重程度[14]。

在DSS给药期间，根据品系和基因型差异，小鼠体质量可能明显降低。停用DSS后，小鼠的体质量会持续下降，疾病病理状态评分有可能继续升高。因此，采用高浓度的DSS溶液长时间给药方案可能导致实验过程难以控制，会造成实验动物死亡。建议综合考虑给药浓度和给药时间，计算动物负荷剂量，通过预实验评估动物耐受力。如果小鼠体质量减轻(相对于DSS给药前1 d体质量)达10%～20%，建议通过腹腔注射给予无菌盐水(最多1 mL)或提供湿食物，以降低实验动物病死率。如果小鼠体质量减轻超过20%，表现出驼背姿势或移动受限，那么可能需要对动物实施安乐死[12]。

2.2.3 给药周期 停用DSS后，小鼠状态一般2周内可逐渐恢复状态，反复刺激形成慢性炎症表现。通过控制DSS给药的持续时间和重复次数，可以加速肿瘤的形成。通常采取2.5%或更低的浓度与饮用水循环2次以上。汇总不同研究采用的给药周期方案如表1所示。Angelou等[1]比较了不同给药方案的病理发展阶段，3% DSS 5 d、2.5% DSS 7 d，3个循环后，第84天时C57BL/6小鼠均表现为腺癌；而采用2.5% DSS 5 d、3个循环的方案，第60天小鼠表现为腺瘤，认为该方案可作为诱导成腺瘤的适合方案。

3 动物病理状态评估方法

3.1 疾病活动指数评分(DAI评分)方法 实验过程中观察并记录小鼠的营养状况、活动状况、毛发、食欲、大便性状、OB实验结果等，定期称量并记录其体质量，应用体质量下降分数、大便性状分数、便血分数三项均值的DAI评分进行评价[2]。

3.2 结肠损伤及疾病发展程度评价 到实验节点，麻醉后处死动物，获取结直肠标本，通过病理观察来评价模型动物的结直肠炎癌转化的阶段和严重程度，是通常选用的方法。随着时间的增加，实验动物呈现出急性炎症期、慢性炎症期、肿瘤生成及发展的不同阶段，在病理标本中表现为“正常黏膜上皮→异常隐窝灶→微腺瘤→腺瘤→原位癌→侵袭性癌”的出现与程度差异。

炎症向癌症转变的过程是一个连续的过程，如何评价中间状态非常困难。评估不同病理类型的肿瘤发生数量和比例可反应癌症发生发展的程度。Son等[9]比较了不同取样时间的低程度恶性腺瘤、高度恶性腺瘤、癌症有黏膜侵犯、癌症与黏膜下层侵袭的发病率来比较结肠标本中腺瘤和癌症的发生率和多样性。Koerner等[10]比较了给药后7、14、28、35、56 d的结肠肿瘤病变情况，通过半定量宏观估计结直肠肿瘤(直径≥2 mm的病变)的数量；基于炎症严重程度、炎症范围、隐窝损伤和累及程度4个不同的参数来定义结肠切片的组织学评分；肿瘤分级采用病理切片HE染色结果，分为低程度异型增生、高程度异型增生、黏膜内癌和腺癌，采用图表直观地展现出不同组别的发展程度差异。

染色方法的选择也可能影响组织学观察。在用Kreyberg-Jareg方法染色的切片中，隐窝炎、隐窝脓肿以及鳞状上皮化比HE染色方法更容易诊断[3]。

3.3 体外检查方法 AOM/DSS模型的构建是个较为长期的过程，利用高分辨率、高灵敏度的成像手段，实现机体实时无创监测，分析和判断疾病进程非常有意义。近年来，标记物从单标记发展到辅助标记，再到双标记方法，成像方式出现了生物发光成像(BLI)、计算机断层摄影(CT)、核磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影(PET)、荧光分子断层摄影(FMT)和光学相干断层摄影(OCT)的单用及联用等，在监测肿瘤生长、观察肿瘤大小、量化肿瘤血管再生、分析肿瘤细胞的转移机制方面取得进展。

内窥镜检查是一种无创的观察方法。Kodani等[15]开发并验证了可重复的内窥镜评分系统，该系统同时整合了炎症和肿瘤的评估。内窥镜检查建议在完成DSS给药后1周进行，不需要口服泻药清除结肠内容物[12]。超声生物显微镜与结肠镜联用来检测结肠内肿瘤，可分辨出0.1 mm的黏膜层凸起，降低了结肠镜的误诊率，但无法区分病灶是否为良性或恶性[16]。共聚焦内镜可使图像放大1 000倍，能够在体实时显示组织、细胞和亚细胞结构，准确鉴别正常、增生、瘤变的黏膜[17]。

4 肠道菌群

不同的饲养环境或不同批次的小鼠其肠道细菌微环境可能存在差异。研究表明，肠道菌群微环境与结肠炎症的发展相关[18]。一方面，AOM在体内需要肠道菌群相关酶的参与，才能转化为具有烷基化作用的甲基碳正离子；另一方面，肠道菌群对维持机体免疫平衡具有重要作用，能够调节DSS诱导的上皮细胞损伤的敏感性和反应性。幽门螺旋杆菌感染的小鼠由于肠道黏膜屏障功能下降，可出现更严重的炎症症状，发生腺瘤的比例更高[19]。无菌条件下饲养的Balb/c和SCID小鼠，在DSS处理后仅发生黏膜炎症的轻微迹象[20]。因此，为了尽可能获得一致性的结果，建议使用同窝的小鼠；如果无法做到，强烈建议对照组和实验组小鼠放到同一房间内[12]。

5 动物模型与人类疾病的差异

在病理病理学变化方面，鲁香凤等[21]比较了人溃疡性结肠炎(UC)与大鼠模型的组织病理学变化，发现SD大鼠DSS模型早期病变始于固有膜下1/3隐窝萎缩消失，逐渐发展至全层隐窝消失，间质以巨噬细胞为主，未见浆细胞，然后表面上皮变性坏死脱落、糜烂溃疡形成，多个血管腔内可见血栓，偶见机化，腺体不典型增生发生率低；而人UC早期病变始于表面上皮及上1/3隐窝急性炎，隐窝破坏萎缩与隐窝脓肿明显相关，均伴慢性肠炎基础病变及腺体不典型增生，偶见血栓伴/不伴机化。二者的共同点为大肠黏膜隐窝干细胞损伤，不同点为DSS首先损伤大鼠隐窝干细胞，继发炎症，而人UC则相反。

在基因及发病机制研究方面，人类CRC的组织病理学可检测到β-连环蛋白、Kras或p53突变，在AOM/DSS小鼠模型可检测到β-连环蛋白的突变，没有检测到Kras或p53的变；但单独应用AOM的大鼠模型可检测到Kras突变[2]。在肿瘤转移相关研究方面，人类CRC患者在确诊时区域淋巴结中约有50%的转移率，但AOM/DSS诱导的小鼠模型腺癌转移发生率低[22]。因此应根据不同的研究目的选择合适的动物模型。

6 结语

AOM/DSS诱导的结直肠炎癌转化模型是研究结直肠肿瘤在炎症环境中发展机制的有效工具。在病理学方面，从模型中收集的生物样本可用于疾病的病理学分析、免疫浸润和免疫组化研究，以探究潜在治疗靶点、明确相关信号通路以及参与的特定免疫细胞组群；在基因组学方面，从模型中收集的生物样本通过定量PCR和RNA测序、DNA序列分析等分子生物学技术可检测相关基因表达，或应用蛋白质印迹和其他蛋白质组学方法进行蛋白质分析；在药物治疗学方面，该模型与潜在的治疗方式、治疗药物联合使用，可以明确和验证新的治疗靶点[2]。

AOM/DSS小鼠模型构建易受到小鼠品系、饮食习惯、饲养环境的影响。本文汇总了近2年发表的文献资料，在方案细节方面还存在一定的差异，有限的资料不能明确实验动物的确切病理阶段，尤其在异常隐窝生成到腺瘤生成的阶段，目前的研究还不够深入。建议在研究设计时应给予注意，通过预实验来明确影响程度，观察动物病理学阶段，减少实验风险。体外无创检查和监测方法的应用为动物模型的连续性研究提供了更好的支持，为进一步动态研究疾病发生及发展过程提供了更多的选择方案。