线栓插入深度对改良线栓法制备小鼠脑缺血模型稳定性及安全性的影响

庄丽华，孔营楠，杨烁慧，龚志刚，詹松华，刘孟潇，张中帅

(1上海中医药大学附属曙光医院，上海201203；2西门子医疗系统有限公司上海分部)

目前我国缺血性脑梗死发病率高，约占其他类型脑梗死的66.4%[1]。缺血性脑梗死已成为全世界首位死亡原因，具有发病率高、病死率高和致残率高的特点[2，3]。大脑中动脉栓塞模型为研究脑缺血疾病的重要模型，其主要造模方法为线栓法。相关研究多使用大鼠造模，但大鼠不能满足脑缺血疾病基因水平的研究。随着基因工程技术的发展，小鼠和基因工程小鼠已经成为目前研究的热点[4，5]。建立稳定的小鼠脑缺血模型，并创立准确无创的模型评价体系，是目前研究的关键。过去常用TTC染色法来判定模型小鼠脑缺血范围，但该方法无法对活体小鼠进行观察[6～9]。随着医学影像学技术的发展，可利用磁共振扫描技术对小鼠进行活体多层面成像检查[10～14]。2017年10月～2018年4月，本研究用改良线栓构建小鼠脑缺血模型，观察线栓插入深度对模型稳定性及安全性的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 成年SPF级C57/BL6n小鼠40只，雄性，体质量20～25 g，购自维通利华实验动物有限公司，SCXK(浙)2018-0001，饲养于上海中医药大学动物实验中心，温度18～28 ℃，昼夜温差<3 ℃，相对湿度40%～70%。适应性饲养1周，术前12 h禁食不禁水。青霉素钠粉针剂，购自上海上药新亚药业有限公司，水合氯醛购自上海国药集团化学试剂有限公司。线栓购自北京西浓科技有限公司，直径0.16 mm，头部直径(0.2±0.1)mm，线长3.5 cm，距离头端10 mm处有黑色标记，并于标记处前后1 mm处加两个标记。磁共振扫描仪(西门子Skyra3.0T)、8通道横向放置小鼠专用线圈(上海辰光医疗科技股份有限公司，编号5000049101/序列号001006)。

1.2 动物分组及脑缺血模型制备 将40只小鼠采用随机数字表法分为A、B、C、D组，每组10只。将小鼠称质量后用4%水合氯醛溶液按0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉，将其仰卧位固定于泡沫纸板上，乙醇擦拭颈部消毒，用眼科镊在颈部正中剪1 cm左右切口，钝性分离下颌下腺，用玻璃分针游离胸骨舌骨肌及二腹肌之间的颈动脉鞘，分离颈总动脉和迷走神经，在颈总动脉上挂线，并继续向前剥离分出颈外动脉，将颈外动脉和颈总动脉结扎。将线栓插入0.4 mm注射器针头，针头经颈总动脉近心端靠近结扎处插入，推入线栓，退出针头，继续往前推送线栓。B、C、D组线栓头端距颈总动脉分叉处距离分别为9、10、11 mm，标记点到达颈总动脉分叉时停止，固定颈总动脉及其内线栓，剪减掉多余部分线栓及线头。冲洗创面并缝合皮肤，将小鼠置于保温棉垫上，待其苏醒后单笼饲养。A组为假手术组，分离步骤同B、C、D组，分离出颈总动脉、颈外动脉后用手术线结扎，不插入线栓。各组术后均腹腔注射4万U青霉素钠溶液。

1.3 小鼠神经行为判定标准 分别于小鼠完全清醒后(术后)、磁共振扫描前采用Longa′s神经功能评分评价其神经功能。Longa′s神经功能评分0分：无明显神经功能缺损症状；1分：垂直提尾时不能伸展对侧前爪；2分：行走时向偏瘫侧转圈；3分：行走时身体向偏瘫侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失；5分：死亡。

1.4 磁共振扫描及脑梗死范围测算 造模24 h，采用4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，将其置于8通道横向放置小鼠专用线圈中央，采取俯卧位固定，用西门子Skyra3.0T磁共振仪进行扫描，T1WI、T2WI采用快速自旋回波序列扫描，DWI采用梯度回波扫描。参数设置如下：T1WI TSE-TRA脉冲序列重复时间(TR)500 ms，回波时间(TE)13 ms，翻转角131°，视野60 mm×48 mm，带宽244 Hz/Px，激励次数3，矩阵256×256，层数8层，扫描时间167 s；T1WI TSE-COR，TR 761 ms，TE 13 ms，翻转角131°，视野60 mm×36 mm，带宽244 Hz/Px，激励次数4，矩阵256×256，层数10层，扫描时间171 s；T2WI TSE-TRA，TR 3800 ms，TE 80 ms，翻转角150°，视野60 mm×48 mm，带宽260 Hz/Px，激励次数2，矩阵256×256，层数8层，扫描时间179 s；T2WI TSE-COR，TR 3800 ms，TE 80 ms，翻转角150°，视野60 mm×36 mm，带宽260 Hz/Px，激励次数4，矩阵256×256，层数10层，扫描时间171 s。因磁共振扫描小鼠冠状位层面多于横断位层面，故从冠状位层面计算脑梗死体积。采用Image pro plus6.0软件计算小鼠每个层面脑梗死面积，梗死面积×层厚为脑梗死体积，脑梗死体积占全脑总体积的百分比即为脑梗死范围。

2 结果

2.1 各组造模情况 术后24 h磁共振扫描前，A组无死亡；B组存活9只，因脑疝死亡1只，造模成功6只；C组存活8只，因严重脑水肿死亡1只、原因不明死亡1只，造模成功7只；D组存活5只，因脑出血死亡3只、严重脑水肿死亡2只，造模成功4只。

2.2 各组存活小鼠术后及磁共振扫描前神经功能比较 A、B、C、D组存活小鼠术后Longa′s神经功能评分分别为0、1、2、2分；磁共振扫描前分别为0、1、3、2分。术后C、D组Longa′s神经功能评分高于A组,但差异无统计学意义(P均>0.05)；B组高于A组，低于C、D组，但差异均无统计学意义(P均>0.05)。磁共振扫描前C组Longa′s神经功能评分高于A组,但差异无统计学意义(P>0.05)；B、D组高于A组，低于C组，但差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.3 各组磁共振扫描结果及脑梗死范围比较 磁共振扫描结果显示,A组T1WI及T2WI无明显信号改变，B、C、D组分别有3、1、1只无明显信号改变，其他均出现不同程度的T2WI高信号区域。B、C、D组脑梗死范围分别为(17.13±8.32)%、(26.63±5.76)%、(27.52±5.81)%。C、D组脑梗死范围大于B组(P均<0.05)，C组脑梗死范围与D组相当(P>0.05)。

3 讨论

1986年Koizumi等[15]首次通过颈总动脉开口插入线栓制备大脑中动脉闭塞脑缺血模型。Longa等[16]在Koizumi的基础上进行改进，通过颈外动脉开口制备大鼠可逆性脑栓塞模型。线栓法的优点在于术中对血压、体温、血生化等影响小，避免开颅对颅内环境的影响；稳定性强，重复性好，可进行缺血再灌注相关研究，应用颇为广泛[17～20]。但该方法操作复杂，要求操作者动作精细准确，否则极易发生出血及血管痉挛等并发症，同时存在诸多影响因素，需后续研究不断改进与完善。

本研究制备永久性脑缺血模型，选用操作相对简单的颈总动脉进栓，重在探究线栓插入深度对成模率及安全性的影响。预实验发现小鼠颈内动脉解剖位置较深，难以分离，强制分离极易导致血管断裂，而颈外动脉可见部分短，难以像大鼠一样从颈外开口处置入线栓。因此，本研究在分离出颈总动脉及颈外动脉后，采用1 mL注射器针头牵引线栓从颈总动脉直接插入颈内动脉，可降低颈总动脉断裂的概率，且缩短了线栓插入时间，减少了出血量。由于小鼠体质量小，血管细，血管韧性及弹性不如大鼠，成模率低。除去操作因素，造模时线栓头端插入深度是小鼠脑缺血造模成功率的重要影响因素。如线栓头端插入过浅，未能阻断血流则不会发生梗死；如插入过深，则会导致出血，小鼠发生神经功能缺损甚至死亡。本研究结果显示，线栓头端距颈总动脉分叉处10 mm时安全性及成模率较高。线栓头端距颈总动脉分叉处距离为9 mm时，部分存活小鼠未发现信号改变区域，说明未形成梗死灶，即造模失败。当线栓头端距颈总动脉分叉处距离为11 mm时，小鼠死亡率升高。

本研究观察术后各组神经功能评分，以初步观察造模是否成功。各模型组发生不同程度神经功能缺损，说明线栓到达了大脑中动脉起始部。磁共振扫描前各组神经功能评分较术后略低，但差异无统计学意义，说明从术后到磁共振扫描期间模型组神经功能自我恢复并不明显。有研究采用以上方法造模后1周内模型的神经功能评分与脑梗死体积不会自行恢复，而1周后才会大幅度恢复[21]。磁共振扫描前线栓插入10 mm与11 mm的小鼠神经功能评分高于插入9 mm的小鼠，说明插入9 mm深度不够，未能完全阻塞大脑中动脉。

磁共振扫描技术在临床广泛用于脑缺血的诊断[22,23]。在梗死急性期，DWI为高信号，T2WI或FLAIR像出现高信号；亚急性期时可见T1呈低信号。本研究结果显示，梗死区域T1WI信号降低不明显，T2WI及DWI明显高信号。本研究使用8通道横向放置小鼠线圈扫描，图像质量佳，病灶显示清晰，可准确判断梗死灶及梗死范围。部分小鼠无行为学损伤表现，但磁共振扫描T2WI有大片高信号区域。说明小鼠行为学评分对梗死的判断不如磁共振扫描灵敏。本研究发现，线栓插入10、11 mm时，脑梗死范围大于插入9 mm；插入10 mm与11 mm时梗死部位稳定，范围较为一致。但插入11 mm时小鼠死亡率达50%。通过解剖死亡小鼠发现，部分小鼠大脑中动脉被插破，部分小鼠因出血而发生神经功能缺损。死亡和行为学表现均因出血所致，可见插入11 mm的深度易导致出血。

总之，线栓法是制作小鼠脑缺血模型的可靠方法。小鼠脑缺血模型制作难度大，进线深度起决定性作用，过浅或过深均会影响脑缺血模型的安全性及稳定性，对实验结果造成影响。通过对插线深度的改良，制作较为稳定的小鼠脑缺血模型。线栓插入深度为10 mm时安全性及成模率较高。但本研究也存在不足，各组小鼠样本量少，需加大样本量对结论进行验证；另外，本研究仅对20～25 g的小鼠进行观察，其他品系及体质量小鼠的适宜插入深度则需进一步研究。尽管本研究得出了适宜插入深度，但由于小鼠大脑中动脉直径及颈总动脉分叉至大脑中动脉距离存在个体差异，因此在造模过程中操作人员的“手感”和熟练度起重要作用。