禽偏肺病毒病原学及病毒分离鉴定

宇 凌，王 强，玄振盈，董翠梅，魏中锋*

（1.山东省菏泽市动物疫病预防控制中心，山东 菏泽 274000；2.山东省泰安市岱岳区山口镇兽医站，山东 泰安 271000；3.山东省泰安市岱岳区祝阳镇兽医站，山东 泰安 271000）

禽偏肺病毒（aMPV）亦称火鸡鼻气管炎病毒（TRTV），属于副粘病毒科、肺病毒亚科、偏肺病毒属，该病毒是有囊膜，不分节段的单股负链RNA病毒。Buys等在1978年从南非火鸡的鼻窦分泌物中首次分离出病原体[1]。随后欧洲、北美洲和亚洲相继报道了该病的存在。20世纪80年代以后，又从出现呼吸道症状、并伴有肿头的病鸡中分离到了aMPV病原体。除澳大利亚外，世界上所有主要家禽饲养地区均有报道有aMPV感染[2]。中国于1998年由沈瑞忠等首次报道了aMPV的存在。感染该病毒的火鸡会出现严重的呼吸道症状，并且在火鸡养殖业，aMPV引起的呼吸道疾病所造成的危害仅次于禽流感病毒，常造成巨大的经济损失。此外，aMPV是导致鸡群肿头综合征的主要诱因之一，但其作为一种主要病原体的机理尚不清楚，鸡只感染时会出现脸面肿胀，剖检肿胀处有黄色干酪物。aMPV的感染率高达50%～100%，死亡率2%，出现与细菌或病毒的混合感染时，死亡率达到25%，aMPV感染给养禽业带来巨大的经济损失[3]。

1 aMPV的病原学

1.1 aMPV的病原学特性

aMPV属于副粘病毒科、肺病毒亚科，肺病毒亚科又可分为肺病毒属和偏肺病毒属，偏肺病毒属包括aMPV和人偏肺病毒（hMPV）[4]。aMPV基因组全长为13.1～14.2 kb，基因组编码N-P-M-FM2-SH-G-L8蛋白。aMPV虽然有促进细胞融合的F蛋白，但其糖蛋白（G）中没有神经氨酸酶活性，因此这些病毒不具有血凝作用，这也是区别于其他副粘病毒的一个重要特征[5]。在负染电镜下，aMPV呈直径为50～200 nm的高度多形性颗粒，通常是球形，也会出现长度＞1 000 nm纤丝，特别是在器官培养繁殖的传代中。其核衣壳呈螺旋状，病毒粒子表面会有13～14nm的纤突[6]。

1.2aMPV的分类

根据遗传进化分析和抗原变异，aMPV共被分为A、B、C和D 4个亚型[7-9]。A和B亚型的aMPV存在于除北美和澳大利亚之外的大多数国家，C亚型病毒目前在北美洲、法国、中国和韩国被报道，而D亚型病毒目前只在法国被报道[10-11]。在A、B、C、D 4个亚型的遗传进化树上，A、B、D 3个型在一个分支上，C亚型单独在一个分支上。在4个亚型aMPV与hMPV的遗传进化树上，C亚型与hMPV在一个分支上。

1.3aMPV对禽的致病性

1.3.1 aMPV对火鸡的致病性

aMPV引起火鸡严重的呼吸道感染，其临床特征为：打喷嚏，气管啰音，眶下鼻窦肿胀，鼻塞，泡沫性结膜炎，眼分泌物增多。鼻分泌物可能由于继发性细菌感染而变得更多、更黏稠，同时还会出现咳嗽和神经性症状的现象[12]。与其他家禽呼吸道感染一样，如果饲养条件差或继发性细菌感染，可能会延长气囊炎、心包炎、肺炎和肝炎周期的时间，从而增加发病率和死亡率。临床调查表明，aMPV可增强禽鼻气管炎鸟杆菌的感染[13]。

在产蛋火鸡中，aMPV感染导致产蛋数量和蛋壳质量下降。感染火鸡恢复可能需要3周的时间，在这段时间内，火鸡多产薄壳蛋，蛋壳质量变差，也有产蛋火鸡感染后发生腹膜炎的报道。目前尚不清楚输卵管组织是否确实易受aMPV感染的影响，或者对生殖道的影响是否源于系统效应。

1.3.2 aMPV对鸡的致病性

aMPV可感染鸡，并诱导特异性抗体应答[14]。当鸡肿头综合征（SHS）第一次在鸡群中报道时，火鸡感染aMPV也出现了同样症状，因此人们认为aMPV是引发SHS的主要诱因，但出现SHS并不总是与aMPV有关[15]。鸡的继发性细菌感染如大肠杆菌病和传染性法氏囊病的免疫抑制作用在典型的SHS的发生发展中起着重要的作用。SHS疾病特征包括眶内和眶周鼻窦炎、鼻分泌物、结膜炎、斜颈以及脸和下眶窦的肿胀。虽然死亡率很少超过2%，但是发病率可能达到100%，而且在种鸡群中，蛋的质量会受到影响[16-17]。SHS在肉鸡和种鸡群中都有报道，但鸡群出现SHS症状，aMPV并不是唯一的病原。例如，在第一例来自南非的SHS报告中，同样分离出传染性支气管炎（IBV）病毒[18]。从美国加利福尼亚州的SHS病例中分离到IBV和大肠埃希菌。在一项研究中，大肠杆菌也能造成鸡群的肿头症状。在肉鸡中，aMPV可能不是一种主要病原体，或许与另一种呼吸道疾病复合物中的其他病原体有关。

2 疑似样品的采集与处理

在实际生产中，可尝试从鼻甲、鼻窦或气管组织或其拭子中分离病毒[19]。有研究显示，通过对试验接种鸡的全部组织和器官的检查，证实了利用肺和非呼吸道组织进行病毒分离的效果并不好。有研究发现，从接种强毒的试验鸡的鼻、口腔和咽拭子中均可分离出aMPV，从感染鸡的鼻、口腔和咽拭子分离病毒同样可行也并无差别。大部分的aMPV在感染火鸡和鸡的鼻腔组织或气管中进行复制增殖，在肺和气囊中发现的病毒数量较少[20]。

采集疑似样品组织之后，应立即处理病料。将样品与PBS 1：5稀释之后进行组织研磨，再加入双抗防止细菌污染，并保存于-80℃超低温冰箱备用。分离毒株或提取RNA时需进行离心取上清进行下步实验，但该方法不适合长距离多样品的采集；有报道用直接印模涂片法或组织匀浆上清液接种FTA卡法采集感染aMPV雏鸡的鼻甲、气管和肺组织，RT-PCR均呈阳性。该研究还表明A、B两种亚型aMPV病毒接种FTA卡在4～6℃下可以保存60 d，仍可进行分子鉴定。FTA卡为aMPV阳性样品的采集和运输提供了一种简单易行的方法，为分子流行病调查提供了可靠、无危害的RNA来源[21]。

3 aMPV病毒的分离鉴定

在临床上，aMPV的分离非常困难。因为病毒在感染禽后，其在禽体组织内或者排泄物中存在的时间很短，这使得在实际临床中很难确定感染的起始时间和取样时间，其次在病毒感染第4天之后通过RT-PCR和病毒分离鉴定病毒更困难。病毒分离的材料最好是在临床症状出现之前采取，或者至少在怀疑感染的第一时刻，这在实际生产中是很难做到的[22]。更重要的一点是，从田间样本中分离aMPV并不容易，由于某些原因从鸡体内分离病毒似乎比从火鸡中分离病毒更困难。

3.1 气管环分离培养

禽胚气管环组织培养（TOC）即禽类的气管环，常用于禽类病毒如传染性支气管炎病毒、偏肺病毒等的分离、培养等研究。TOC首选为17～20日龄的SPF鸡胚或火鸡胚（8～10日龄）的气管环，也可用无aMPV抗体的1～2日龄的雏鸡制作气管环培养物。这种培养物可以维持数周，接种病毒样品之后通过观察纤毛运动的停滞来判断病毒是否增殖。一般在aMPV感染1周后纤毛活动停滞，之后还要继续培养几代。一般使用TOC盲传3～4代之后可以让培养上清液适应Vero细胞，再盲传3～4代，可以看到细胞病变（CPE）或者通过间免检测到病原。一些早期分离到的A亚型和B亚型的aMPV都是通过这种方法得到的。

3.2 鸡胚的分离培养

很多病毒可以适应禽胚，利用禽胚增殖病毒，或者开展对病毒特性的研究。对偏肺病毒，常用6～8日龄SPF鸡胚，并经卵黄囊接种培养5～8 d后，无菌被收集其尿囊液和卵黄囊膜之后进行传代。经过2～3代的盲传后，如果看到出血胚胎和一些禽胚的死亡发生，立即将鸡胚培养物如尿囊液接种细胞培养继续培养。一旦病毒在SPF鸡胚上成功进行病毒培养，该病毒就可以很容易地适应在各种细胞培养中生长，例如鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸡胚肝细胞（CEL）、哺乳动物Vero细胞株等，从而为进一步的研究奠定基础。