外泌体在肿瘤转移过程中作用机制的研究进展

陈伟明,鹿洪亭

(青岛大学附属医院，青岛266003)

近些年来，越来越多的靶向药物、免疫疗法和液体活检等在临床上应用，大部分早期肿瘤患者都能得到有效的诊疗，但是仍有很多晚期癌症患者因肿瘤发生转移而死亡。因此，对肿瘤转移过程的进一步研究尤为重要。目前认为肿瘤转移的过程包括原位瘤的肿瘤细胞侵袭突破基底膜渗入血管，在血液循环中存活，随着血液传播至远端血管，附着并外渗出血管，最终在转移部位定居和生长[1]。过去认为肿瘤细胞是通过细胞间的直接接触和分泌可溶性蛋白因子(如细胞因子和生长因子)进行交流，但越来越多研究[2]表明，细胞和细胞之间也可以通过细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)进行信息交流。EVs是原核细胞和真核细胞释放的所有类型囊泡的总称，包括外泌体、微囊泡等[3]。外泌体(exosomes)是EVs中的一种直径在30～150 nm，具有磷脂双分子层的囊泡。在1979年，Trams等[4]首次使用“exosomes”这个词来定义由正常细胞系和肿瘤细胞系质膜来源的微囊泡。几乎所有的活细胞均可以产生外泌体，其组成成分包括核酸(例如miRNA、lncRNA、DNA等)、蛋白质、脂质等，广泛存在于血液、泪液、尿液、唾液、乳汁、腹水等体液中，是由母细胞膜内陷形成的多囊泡体与膜融合后释放到胞外，作用于邻近或远处的受体细胞[5]。对于外泌体的分离和鉴定方法仍存在较多的限制，但目前比较常规的方法是使用差速超速离心法来分离外泌体，通过蛋白免疫印迹、透射电子显微镜和纳米粒子跟踪分析对外泌体进行鉴别[6]。外泌体含有生物大分子参与细胞间信息交流，它们具有增加肿瘤细胞侵袭能力和促进肿瘤转移的作用，成为近年来肿瘤领域的研究热点。近些年外泌体逐渐成为国内外研究的热点，但目前国内关于外泌体在肿瘤转移的研究综述仍缺乏对肿瘤转移不同过程的系统阐述。因此，现将外泌体在肿瘤转移过程中的作用机制相关报道综述如下。

1 提高肿瘤的侵袭能力

肿瘤细胞想要传播至宿主器官进行转移，需要它们能突破基底膜、渗入和渗出血管。但不论是上述过程，还是肿瘤在原发部位和转移部位的生长均和肿瘤微环境密切相关。肿瘤微环境除了肿瘤细胞，还含有大量的间充质干细胞、免疫细胞、内皮细胞、细胞外基质等成分。外泌体尤其是肿瘤细胞来源的外泌体(tumor derived exosomes, TDEs)在肿瘤细胞和肿瘤微环境之间的信息交流对促进肿瘤转移发挥着重要作用[7]。

1.1 促进肿瘤细胞的上皮—间质化(EMT) Zomer等[8]证实，高侵袭性的肿瘤细胞来源的外泌体可增加低侵袭性肿瘤细胞的侵袭性。紧密连接是内皮细胞和上皮细胞黏附复合物的主要组成部分，所形成的的天然屏障可以限制肿瘤细胞的转移。但是这种天然屏障会被TDEs破坏，从而促进肿瘤细胞渗入和渗出血管。TDEs中的miR-105可以下调靶基因ZO-1的表达，ZO-1作为紧密连接的重要组成成分，其表达下调可明显减少紧密连接。在小鼠体内实验[9]证实高表达miR-105的TDEs能显著提高脑转移和肺转移的发生，并伴有内皮细胞ZO-1表达下调和血管通透性增加。

EMT指的是上皮细胞失去上皮特征而获得间质特征的细胞过程。EMT与肿瘤转移过程密切相关，在肿瘤微环境的调控下，上皮肿瘤细胞发生EMT，表现出低增殖性、高侵袭和转移能力，利于肿瘤的转移；而当肿瘤细胞到达远隔器官的转移前微环境时，将发生相反的间质-上皮转化，恢复其高增殖状态，利于转移瘤的生长[10]。抑癌基因P85α表达下调的间质成纤维细胞来源的外泌体通过激活Wnt通路诱导癌细胞的EMT，从而促进乳腺癌肿瘤细胞的转移[11]。高表达lncRNA-UCA1的膀胱癌细胞系，可通过外泌体传递lncRNA-UCA1至低表达lncRNA-UCA1的膀胱癌细胞系，通过EMT来促进肿瘤的侵袭和生长[12]。

1.2 参与血管生成 肿瘤的生长过程中会激活更多的新生血管生成，为自身输送更多的营养血液，来避免肿瘤坏死的产生。TDEs介导肿瘤细胞与微环境之间的信息交流，在促进血管生成过程也发挥重要作用。鼻咽癌细胞来源的外泌体含有miR-23a作用于内皮细胞，调节靶基因TSGA10的表达，促进血管生成[13]。含有miR-25-3p的TDEs进入内皮细胞靶向KLF2和KLF4，调控VEGFR2、ZO-1，闭锁蛋白的表达，提高血管通透性和促进新生血管生成。进一步动物实验证实，外泌体中的miR-25-3p能显著提高小鼠肝转移和肺转移的发生[14]。TDEs还可作用于骨髓来源的间充质细胞，诱导其分化为α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin, αSMA)阳性的肌成纤维细胞，后者又能提高肿瘤细胞增殖、侵袭能力和促进血管生成[15]。

1.3 参与形成免疫抑制微环境 TDEs可同时抑制细胞免疫反应和体液免疫反应来维持肿瘤细胞的增殖。TDEs和大多数免疫细胞之间都有联系，通过多种途径来干扰免疫细胞的功能，包括向免疫细胞传递耐受信号、抑制免疫细胞的增殖、诱导CD8+T细胞的凋亡、抑制NK细胞的活性、干扰单核细胞分化、使髓样前体细胞分化成骨髓来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)及促进调节性T细胞的分化和扩增，从而形成一个有利于肿瘤进展的免疫抑制微环境[16]。例如，上皮性卵巢癌来源的外泌体可通过下调NK细胞的NKG2D受体，来抑制NK细胞的细胞毒性作用[17]。活化的T细胞来源的外泌体通过Fas/FasL信号通路上调肿瘤细胞MMP9的表达，提高肿瘤细胞的侵袭能力，从而促进黑色素瘤和肺癌的转移[18]。

2 在血液循环中协助肿瘤细胞逃脱免疫细胞攻击

入血液的循环肿瘤细胞要想存活就必须逃过免疫系统的监视。血小板在协助肿瘤细胞免受免疫细胞的攻击上发挥重要作用。血小板能黏附在循环肿瘤细胞表面，协助肿瘤细胞逃避NK细胞的杀伤作用[19]。此外，血小板还可增加肿瘤细胞的侵袭性。Pang等[20]证实凝血酶激活的血小板可诱导肿瘤细胞成为一种更具侵袭性的表型，而血小板膜蛋白p-选择素和糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)在协助于肿瘤细胞渗出血管中发挥重要作用。活化的血小板分泌的外泌体(PMPs)也含有p-选择素、GPⅡb/Ⅲa、生物活性脂类和分泌蛋白等，PMPs与肿瘤细胞共培养能显著提高肿瘤细胞增殖、侵袭和转移能力[21]。PMPs水平上调和肿瘤的进展以及不良的预后有关。Ⅳ期黑色素瘤患者PMPs在血液中的水平显著高于Ⅲ期黑色素瘤患者，而且Ⅳ期黑色素瘤患者PMPs的血栓形成活性显著升高[22]。

血液循环中的外泌体来源于多种活细胞，外泌体的数量、大小和所含功能性分子在不同疾病患者的血清、尿液、唾液等中均有明显差异表达，因此能作为疾病诊断、进展和预后的重要生物标志物[23]。TDEs作为肿瘤诊断、进展和预后的生物标志物的显著价值得到了越来越多的研究证实。例如，磷脂酰肌醇聚糖1(GPC1)阳性的外泌体在早期胰腺癌患者的血清中的水平就显著高于正常人群[24]。肾细胞癌舒尼替尼耐药相关的lncRNA ARSR可通过外泌体传播舒尼替尼耐药性，研究进一步证实，lncRNA ARSR通过和肿瘤细胞内的miR-34/miR-449竞争性结合提高ALX和c-MET表达来促进舒尼替尼耐药，因此，lncRNA ARSR可作为舒尼替尼耐药的预测分子和治疗靶点[25]。

3 参与转移前微环境建立和决定转移器官倾向性

早在1889，Paget就提出了“种子和土壤假说”，认为只有在种子(循环肿瘤细胞)和土壤(宿主器官)相适应时，转移瘤才会形成[26]。转移前微环境的建立是肿瘤细胞定居于转移部位所必须的，而且和肿瘤细胞转移的器官倾向性密切相关。转移前微环境的形成需要骨髓源性细胞、免疫细胞、内皮细胞和间充质细胞的共同作用[27]。

3.1 参与转移前微环境的建立 肿瘤细胞来源的外泌体可教化受体细胞成为一种促转移和促炎性的亚型，从而营造一个有利于肿瘤细胞定居的转移前微环境[28]。含有miR-122的TDEs作用于转移前微环境中的非癌性细胞，使后者细胞内的丙氨酸激酶表达下调，减少对葡萄糖的摄取和利用，从而增加肿瘤细胞的营养支持[29]。胰腺导管腺癌TDEs可诱导小鼠肝脏转移前微环境的形成，增加肝转移的发生。机制上，胰腺导管腺癌TDEs可诱导肝窦内的Kupffer细胞分泌转化生长因子β(TGFβ)和促使肝星状细胞的纤维连接蛋白的表达上调，所形成的的纤维化环境可募集骨髓来源的巨噬细胞。TDEs中的巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)表达显著增加，并且有利于转移前微环境的形成和促进肿瘤转移。在和无转移的胰腺肿瘤相比，发生肝转移的Ⅰ期胰腺导管腺癌患者TDEs中的MIF水平明显升高[30]。

3.2 引导肿瘤转移的器官倾向性 肿瘤细胞来源的外泌体可直接靶向转移部位，营造一个转移前微环境，为肿瘤细胞的定居和增殖做准备。通过绿色免疫荧光标记乳腺癌细胞来源的外泌体，在乳腺癌裸鼠模型中发现TDEs不仅在周围的微环境中富集，还出现在血循环中以及转移部位[31]。用具有肺转移倾向的TDEs处理小鼠后可使具有骨转移倾向的肿瘤细胞重新定向。而且不同器官倾向性的TDEs具有不同的整合素表达，整合素α6β4和α6β1与肺转移相关，而整合素αvβ5与肝转移相关[32]。

Zhang等[33]发现了另一种转移器官特异性的有趣现象，为肿瘤转移的机制研究提供了新的思路。正常表达PTEN的肿瘤细胞转移到脑部后PTEN的表达下调，下调PTEN的肿瘤细胞离开脑部后PTEN的表达水平又会恢复，但在其他器官却没有发现类似的现象。研究进一步发现，星型胶质细胞来源的外泌体转载的miRNAs可作用于转移肿瘤细胞并靶向PTEN。当下调星型胶质细胞中靶向PTEN的miRNAs或者阻断星型胶质细胞分泌外泌体可抑制脑转移。此外，肿瘤细胞的PTEN丢失使得趋化因子CCL2分泌增加，募集Iba1阳性表达的骨髓来源的细胞，促进肿瘤细胞的增殖和抑制凋亡。

综上所述，外泌体可在细胞和细胞之间传递信息，可通过提高肿瘤细胞的侵袭能力、诱导新血管生成、转移前微环境的建立和引导肿瘤转移的器官倾向性等途径促进肿瘤的转移，尤其在引导肿瘤转移的器官倾向性上，为科研人员对肿瘤转移的机制研究提供了新的方向。肿瘤患者和健康患者以及不同肿瘤进展阶段的患者之间对比，血清中的TDEs所含内容物成分的差异表达，为临床上对肿瘤的诊断、治疗和预后评估提供了更多生物标志物的选择。肿瘤细胞基因水平和蛋白水平在肿瘤发生发展过程的机制探讨是一项巨大的长期工程，但外泌体作为肿瘤细胞信息传递的关键途径，对其内含物所包含的有限信息的进一步探索，一定会在未来几年里为肿瘤的诊疗策略上提供强有力的指导。