蛋白质组学在鱼肉品质研究中的应用

王 琨

（哈尔滨商业大学，哈尔滨 150028）

据统计，人类对动物蛋白的消费需求呈上升趋势，同时也对食物品质提出了更高的要求。作为富含较高蛋白质的鱼类已成为人类饮食中可获得的极其重要的蛋白质来源，其品质的研究也成为了近几年国内外学者的研究热点。在鱼类中，最好的品质是紧实且具有良好水分保持能力的肉质，这些性状主要是由机体蛋白质的本质和属性决定的。食品基质的构建，无论是在细胞和组织范围内，都是由蛋白质调控的[1]。因此，需要可靠的技术分析水产品中的蛋白质，以提高水产品品质。随着后基因组时代的到来，蛋白质组学技术可以在蛋白质水平上筛选出与肉质有关的标记蛋白，为探索肉类品质形成的影响因素提供了新的研究视角。虽然，在水产养殖中，蛋白质组学技术的应用仍处于初级阶段，其进展将比基因组测序速度慢，但已经展现较好的前景。本文对蛋白质组学的定义、“经典”研究方法以及在鱼肉品质研究的应用进行简要综述，以期为今后鱼类肉质改良提供参考。

1 蛋白质组学

蛋白质组（Proteome）的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组表达的所有蛋白质[2]。与基因组不同的是，蛋白质易受环境影响，也随时间的变化在组织中各不相同，具有动态性[3]。目前认为是蛋白质组是特定时刻已知细胞、组织或者器官所有的蛋白质（包括亚型和修饰蛋白质）[4]。因此，蛋白质组学的目标是通过了解蛋白质性质、功能、相互作用和联系及其动态变化规律，最终从生物体生理特点解释遗传与环境如何影响生物功能。

二维凝胶电泳（2-DE）是最广泛使用的蛋白质组学方法，因为其简单、可靠，而且相对实惠。该技术是基于蛋白质等电聚焦（IEF）和相对分子质量不同进行蛋白质分离，可一次分离出数百甚至上千种蛋白质[5]。这种技术分辨率高，对未经处理的样品耐受性好，可以在一个特性的细胞或组织中分离出更多的蛋白质点，使其成为可靠的最佳实验工具之一。因此，其适合全面分析器官中蛋白质的表达。然而2-DE也有一些缺点，例如不能将复杂（组织）样本中的所有蛋白质可视化，一些低丰度的蛋白不易检测，其中包括许多关键细胞信号元件和转录因子，凝胶回收率不稳定，并且这种方法也是凝胶蛋白组学技术以填补2-DE留下的空白或完全消除凝胶技术（包括酵母双杂交和反向杂交两种测定法）以及同位素标记亲和标签技术、噬菌体抗体库、蛋白质微阵列和多维蛋白质鉴定技术等方法[6-11]。上述方法不仅克服2D电泳的部分缺点，还具备以下优点：大规模蛋白表达和描述，消除蛋白质分离过程中耗时的步骤，高灵敏度和小样本量的要求及肽分离的通用机制。然而，这些技术的改进和相关过程目前仍存在局限性，对未来仍是一个挑战[12]。因此，2-DE技术仍然在蛋白质组学研究中发挥着重要作用。

质谱法在生命科学中被广泛应用于蛋白质分析，在蛋白质组学中应用2-DE等分离技术后，在蛋白质的高通量识别鉴定起到重要作用[13]。质谱仪包括3个基本组成成分（离子源、质量分析仪和离子探测器），具有极高的灵敏度。20世纪80年代末，研究人员采用基质辅助激光电离（MALDI）和电喷雾电离（ES）这两种软电离技术应用到蛋白质的结构分析中，推动了生物质谱技术的发展[14]。事实上，基于质谱技术（MS）的蛋白质组学是蛋白质组学研究的关键技术之一，根据Guerrera等的说法，MS是几乎所有蛋白质组学实验的核心，因为其提供了蛋白质分析的关键工具——其独特的重量，但对于大多数实验来说，不是整个蛋白质的质量，而是由酶分解产生的肽的质量[15]。因此，质谱分析技术仍有一定的缺点，比如不能区分几种特殊氨基酸，有些固有序列不能测定等。随着基于MS的蛋白质组学技术的发展，高通量鉴定蛋白质相对定量已经成为可能，复杂混合物中单个肽的绝对定量已经能够实现，高度修饰后的蛋白质可以完全进行质谱分析[16-18]。然而，在今后蛋白质组学的研究中，仍然面临着诸多挑战，尤其是在复杂的样品研究中的灵敏度提升、整个蛋白质测定的新方法、动态显示和检测蛋白质的范围等。

2 蛋白质组学技术在鱼肉品质研究中的应用

与其他食品相比，鱼类质量评估受到越来越多的关注和更多的研究。将蛋白质组技术应用于鱼肉品质研究的主要目标是获取鱼肉品质变化中蛋白质的作用机制，从全新的角度来分析与肉质相关的问题，有望达到改良肉质的目的[19]。一般来说，鱼类肉质除了由遗传因素决定，还受“鱼类福利”、食物组成与营养水平及死后加工方式、贮存温度等多因素影响。但无论何种因素，最终都是取决于肌肉组织自身的生化代谢改变结构特性，如嫩度、多汁性、肌内脂肪含量和肌纤维特性[20]。

2.1 “鱼类福利”影响

鱼类福利可通过表观、生长状态、应激反应、动物行为和死亡率等生理指标来评价。许多学者研究认为，当环境发生改变或受到压力等影响，鱼类会出现繁殖能力下降、生长周期变长，甚至死亡率上升等变化。从这个意义上讲，“鱼类福利”可以直接影响鱼类在生长期间的质量。Veiseth-Ken在受到40 min拥挤压力的大西洋鲑Salmo salar肌肉中发现了27个蛋白质点，包括结构蛋白（即原肌球蛋白、肌动蛋白、重链肌球蛋白和轻链肌球蛋白）和肌质蛋白[21]。另一方面，大西洋鲑血浆载脂蛋白AI降低，血管紧张素原补体成分C3含量增高，所有这些蛋白质都参与不同的二级和三级应激反应，改变能量代谢，渗透调节和免疫功能，这种变化不仅与鱼类的生理应激反应相对应，还导致肌肉pH下降，从而影响水产制品品质变化。Morzel等研究了两种不同的屠宰程序，以宰杀前15 min高密度聚集与对照组相比，研究虹鳟肌肉蛋白质的变化，在试验过程中，使用双向电泳分离蛋白质，并通过MALDI-TOF光谱法鉴定目标，结果发现，在死后45 min和24 h分别在两组鱼之间差异地显示了29和4个蛋白质点，鉴定出的蛋白质点主要对应于能量产生途径（磷酸丙糖异构酶、烯醇酶、丙酮酸脱氢酶）或结构蛋白（结蛋白、cap-Z、肌球蛋白重链片段）中涉及的蛋白质[22]。因此，鱼类在宰杀前受到强烈肌肉活动对鱼的肌肉完整性及质构特性也会产生不良影响。王彦波等研究不同宰杀方式对鲫鱼肌肉质构和蛋白质组的影响，结果表明，致死方式影响鲫鱼肌肉中蛋白质的含量与代谢，表现为肌肉的硬度、咀嚼性和胶黏性等质构指标发生变化[23]。此外，鱼类生长环境的不同也会对鱼类的感官和质构特性产生较大的影响，这在一些研究中也得到证实[24-26]。由此可见，利用蛋白质组学研究有肉质相关的蛋白质的表征及动态变化，易于从分子水平上揭示“鱼类福利”对水产动物品质影响机制，为鱼类养殖环境的优化提供理论依据。

2.2 饲料组成

毫无疑问，鱼体肌肉营养成分是衡量鱼肉质量的重要指标，也是消费者关注的问题。影响鱼类肌肉营养成分的主要因素是饲料，饲料的组成成分会对机体成分产生一定的影响。当鱼类食用某些有异味物质的饲料，在肌肉中的残留达到一定浓度时，就会影响鱼类肉质的风味。蛋白质组学在研究饲料成分对鱼类代谢影响方面发挥重要作用。Rufino等通过研究分析在鱼类养殖过程中加入饲料添加剂山楂酸与对照组比较的金头鲷幼鱼的肝脏中差异表达的蛋白质信息，结果表明，饲料添加剂可刺激鱼类的生长，影响鱼肉的质量[27]。Martin等使用蛋白质组学方法研究虹鳟肝脏的蛋白质特征，结果发现，饲喂不同日粮的鱼的蛋白质生长率没有差异；然而，饲喂大豆蛋白质越多，鱼的蛋白质消耗越快而结构蛋白合成效率较低，氨的排泄增加以及肝谷氨酸脱氢酶和天冬氨酸氨基转移酶（ASAT）的活性增加，导致虹鳟的代谢变化，影响鱼肉的品质[28]。

2.3 死后代谢机制

鱼类死后的加工方式和贮藏会影响肉质，鱼肉产品贮藏加工过程中由于蛋白水解导致质构特性发生改变，肉质变软，同时伴有细菌腐败，最终影响水产品品质。很多研究表明，钙蛋白酶和组织蛋白酶降解肌原纤维，基质金属蛋白酶和基质丝氨酸对细胞外基质的降解，这些生化反应发生的过程被认为是肉质变化的主要原因之一，然而该过程更多的细节仍然未知。Kjaersgard等利用2-DE技术研究发现，与新鲜的鳕鱼比较，死后鳕鱼肌肉有11个蛋白质点的丰度发生了变化，其中8个蛋白质点的丰度显著增加，分析表明这些蛋白质点是肌肉组织的部分分解产物。还发现，有11个蛋白质点的丰度发生显著变化，其中9个蛋白质强度增加，并且对于其中8个，在死后的前2 h内增加显著（P＜0.05）[30]。相反，强度降低的两个蛋白质点在8 d后显示显著变化（P＜0.05），从而表明在鱼类死鱼肉生化反应过程是由蛋白质变化导致。因此，应用基于2-DE的蛋白质组学技术的对于更深入的研究鱼类死亡后新陈代谢分子机制与肉质变化之间的关联性具有重要价值。

3 研究展望

以蛋白质组学技术为手段对水产品品质的研究报道逐年增加，但在实际的水产养殖中，蛋白质组学还是没有得到更广泛的应用[31-32]。尤其是什么方法最适合于鱼类样品的蛋白质组分析，如何验证不同实验室使用现有技术确定的相关结果，以及蛋白质表达变化的预测因子等方面仍有很大的研究空间。未来，各种操作简便、灵敏性高等更具成本效益技术的发展，将进一步提高蛋白质组学技术在水产养殖领域的价值，在水产动物研究中扮演越来与重要的角色[33]。随着鱼类蛋白质组信息数据库的不断增加，同时与其他学科加强合作，包括生理学、细胞生物学和计算机科学，以及水产养殖和食品工业等，必将为在水产养殖领域改进、增加甚至创造相关产品提供新机遇。