禽霍乱诊断技术

禽霍乱（Fowl cholera）又名禽巴氏杆菌病，其病原为多杀性巴氏杆 菌（Pasteurella multocida），是一种禽类的高度接触性传染病。本病全世界范围内均有发生，该病急性暴发时，发病率和死亡率均较高，会对禽类养殖业带来巨大的经济损失。世卫组织（OIE）将此病列为必须报告的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。

一、流行病学诊断

本病是由多杀性巴氏杆菌引起的多种禽类的传染病，对鸡、火鸡、鸭、鹅等家禽以及其他鸟类均易感，家禽中火鸡最易感。该病的发生无明显的季节性，全年均可发生，但阴雨潮湿的季节最易感染。按病程可将禽霍乱分为最急性型、急性型和慢性型。所有日龄禽类均可感染发病，但性成熟的青壮年鸡群最易感，而16周龄以下的鸡有较强的抵抗力。

二、临床诊断

1.最急性型。较多见于流行初期。病初禽类无明显症状，突然表现为痉挛、挣扎并快速死亡。

2.急性型症状。急性型较常见于流行初期。病初无明显症状，禽只突然死亡，随后感染禽只厌食、抑郁、流涎、不安、痉挛、抽搐、，发热、腹泻、羽毛粗乱、呼吸困难，，此外还伴有剧烈的腹泻，排出绿色、黄绿色清水样稀便，恶臭。产蛋鸡停止产蛋。最后衰竭、昏迷而死亡。临死前出现发绀，鸡冠、肉垂呈黑紫色。病程0.5～3 d，病死率高。

3.慢性症状。对急性型耐过的禽只或是感染了弱毒菌株的禽只表现为慢性型的病程。其特点是患病的禽只具有局部感染的特征。纤维性化脓性渗出、坏死或不同程度的纤维化发生在各个关节、脚趾垫、肌腱鞘、粘膜组织、气囊、中耳、喉肺或骨髓等处。

4.病理变化。（1）最急型。禽只死亡后剖检，其病理变化不显著。（2）急性型。全身充血，以腹腔脏器的静脉瘀血最为明显。肝脏表面有边缘规整的灰白色针尖大坏死点。心包存在积液，心脏的内、外膜出血。肺出血、水肿。十二指肠黏膜弥漫性出血。脾脏坏死。腺胃出血。产蛋鸡的成熟卵泡外观松软，血管模糊。（3）慢性型。主要表现为纤维素性化脓性渗出，坏死和不同程度的纤维化，具体表现因病原侵害的器官不同而有所差异。当侵染主要发生在呼吸道时，鼻腔鼻窦分泌大量黏性分泌物。当侵染主要发生在关节和腱鞘时，关节肿大变形，分泌炎性渗出物并出现干酪样坏死。某些病禽有斜颈表现的病例中，中耳、颅骨和脑膜等处出现均一的异嗜细胞浸润和纤维素。

三、血清学诊断

血清学检测方法：琼脂扩散试验（不适用于检测水禽体内的禽霍乱抗体）

1.试剂材料。禽霍乱琼脂扩散抗原、标准阳性血清（阳性对照）和标准阴性血清（阴性对照）

2.试验所需溶液。1%硫柳汞溶液、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液溶液（pH6.4）和无菌生理盐水

3.操作方法。根据说明书的要求制备琼脂板。凝固后，使用4 mm直径打孔器，按六角形或梅花形进行打孔。中心孔与外孔的距离为3 mm。取出所打孔中的琼脂，注意不要破坏边缘的琼脂，用酒精灯轻轻烘烤盘底，直到琼脂稍微融化，达到封闭孔底的目的，以防止侧漏。用无菌生理盐水按试剂说明书要求的比例稀释禽霍乱抗原，加入到中间孔中，在外周的1、4孔中加入阳性对照，在外周的2、3、5、6孔中依次加入阴性对照和待检血清。然后静止10 min，将平皿倒置于湿盒内，放置于37℃，反应24 h和48 h分别进行观察记录。

4.结果。试验成立标准：侧光或灯下可观察到，中心孔与阳性对照孔间有一条清晰的白色沉淀线（该沉淀线应与两孔之间的连线垂直），而与阴性对照孔之间无沉淀线。

试验结果确定：若被检血清孔与中心孔间有明显的沉淀线，切位置等同于阳性对照线，则该孔检测结果为阳性；若被检血清孔与中心孔间存在一条较不明显的沉淀线，或是被检血清孔与中心孔之间没有沉淀线，但阳性对照线靠近被测样品孔的一段向中心孔弯曲，均可判为弱阳性，需重复试验，若两次均为可疑，则判该样品为阳性；若被检血清孔与中心孔之间无沉淀线，则为阴性；若被检血清孔与中心孔之间的沉淀线浑浊，并与阳性对照沉淀线交叉，则被检血清孔为非特异性反应，需重复试验。若两次均为非特异性反应，则判该样品为阴性。

阳性或弱阳性结果可确定体内存在禽霍乱抗体。

四、病原学诊断

1.病源分离鉴定方法。（1）样品采集。按照NY/T 541的要求采集并保存样品；最急性或急性病例，可采集濒死或死亡禽只的肝脏、脾脏、心脏和血液等。慢性病例，一般采集有病变的局部病灶组织；活禽可采集鼻腔黏液。不新鲜或可能存在污染的死亡禽只，可采集骨髓样。

（2）镜检样品的制备。制备过程应进行无菌操作，夹取病变组织（肝、脾、心脏），剪成小块，并以其新鲜切面在载玻片上涂抹压印；若样品为血液，蘸取或剪取凝血块，在载玻片上涂抹压印；若是已经培养纯化的细菌，从菌落挑取少量涂片。

（3）细菌培养。可将病料接种于5%鸡血清的葡萄糖淀粉琼脂、鲜血琼脂培养基或5%鸡血清脑心浸出液琼脂培养基，在35℃～37℃下培养18～24 h，产生的菌落直径为1 mm ～ 3 mm 菌落外形呈露珠状，符合其培养特性。

（4）病原鉴定。培养特性：该菌为兼性厌氧菌，其最适培养温度为35℃～37℃，培养18～24 h可形成直径为1 mm～3 mm的菌落，外观呈散在的圆形凸起露珠状，若是有荚膜的菌株则菌落稍大。

（5）显微镜鉴定。样品的干燥和固定:挑取菌落，涂于载玻片，采用甲醇固定或火焰固定。

染色及镜检：使用甲醇固定法时，采用瑞氏或美蓝染色法，镜检时呈两极浓染的菌体，常有荚膜；使用火焰固定法时，采用革兰氏染色法，镜检时为（0.2～0.4）μm×（0.6～2.5）μm大小的革兰氏阴性球杆菌，单个或成对存在。

（6）生化鉴定特性。本菌在葡萄糖、半乳糖、燕糖或果糖等发酵管中接种时产酸但不产气，在鼠李糖、水杨苷、戊醛糖、纤维二糖、棉子糖、菊糖或赤藓糖等发酵管中不发酵；本菌在蛋白胨水培养基接种时，会产生吲哚；本菌在鲜血液琼脂上接种时可生成灰白色，湿润而粘稠的菌落，且不会发生溶血；本菌在麦康凯琼脂上接种时无法生长；培养可产生过氧化筑酶、氧化酶，但无尿索酶、3-半乳糖管酶；维培（VP）试验结果为阴性。

（7）动物接种试验。在稀释细菌纯培养物后，以1 000CFU剂量细菌通过皮下或腹腔内接种小鼠、兔或易感鸡，被接种动物1～2 d内死亡，随后可从被接种动物的肝脏和血液中分离出本菌。

（8）结果判定。符合显微镜鉴定生化鉴定特性的鉴定特征，可确认分离到的病原为多杀性巴氏杆菌。

2.多杀性巴氏杆菌PCR检测方法。（1）主要试剂：灭菌双蒸水或超纯水、电泳缓冲液（TAE）、1.5%琼脂糖凝胶、PCR配套试剂：DNA提取试剂盒、10 X PCR Buffer、dNTPs、Taq 酶、DI 2000 DNA Marker。

3.样品处理。（1）组织样品的处理。取约0.5 g的待检组织样品于灭菌干燥的研钵中充分研磨，加2 mL灭菌生理盐水混匀。反复冻融3 次，3 000 r/min 离心 5 min。取上清液转至无菌的1.5 ml塑料离心管中，编号。样本在2～8℃条件下保存，应不超过24 h。若需长期保存，应放在-70℃以下冰箱，但应避免反复冻融。

（2）纯化和培养细菌样品。用于分离和纯培养的细菌液体培养样品，直接保存在无菌的1.5毫升离心管中。将离心管密封、编号、保存并送检。

（3）基因组DNA的提取。按照DNA提取试剂盒说明书提取处理后的样品、阳性对照和阴性对照的基因组DNA。

（4）反应体系及反应条件。对提取的DNA进行扩增，每个样品20L，反应体系组成如下:

10XPCR 缓冲液2.0 uL

dNTPs（2.5 mmol/L）1.5 uL

引物 KMTI T7（10 umol/uL）1.0 uL。

引物KMT I SP6（10 pmol/u.） 1.0 d。

模板 DNA（样品） 1.0 uL。

Taq DNA 聚合酶 0.5 uL。

纯水 13.0 pL。

总体积 20.0 uL。

反应条件设置：样品反应管瞬时离心，置于PCR扩增仪内进行扩增，95℃预变性 5 min，94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 个 循 环，72℃延伸 10 min。

（5）凝胶电泳。在1 X TAE缓冲液中进行电泳，将扩增产物和DL2000 DNA Marker分别加人1.5%琼脂糖凝胶孔中，每孔加扩增产物10L，80V～100V电压电泳30 min，在紫外灯或凝胶成像仪下观察结果。

（6）结果分析与判定。试验成立条件：阳性对照样品扩增出460 bp片段，且阴性对照没有扩增出任何条带。

结果判定：在试验成立前提下，若扩增出的DNA片段为460 bp，可判定该样品为阳性，否则为阴性。

4.荚膜多重PCR检测方法。

（1）主要试剂。同前述PCR检测方法中要求一致（2）样品处理。同前述PCR检测方法中要求一致（3）基因组DNA的提取。同前述PCR检测方法中要求一致（4）反应体系及反应条件。对提取的DNA进行扩增，每个样品25L，反应体系组成如下:

10 X PCR 缓冲液 2.5 uL

dNTPs（2.5 mmol/L）2 uL

MgCl2（50 mmol/L） 1.0 uL

上 游 引 物 （10 umol/uL） 各0.8 uL。

下 游 引 物 （10 pmol/u.） 各0.8 uL。

模板 DNA（样品） 1.0 uL。

Taq DNA 聚合酶 0.5 uL。

纯水 10.0 pL。

总体积 25.0 uL。

（5）凝胶电泳。同前述PCR检测方法中要求一致。（6）诊断结果判定。试验成立条件：首先，阴性对照不应扩增出任何条带。其次，A型、B型、D型、E型和F型荚膜型阳性对照样品扩增出 1 044 bp、760 bp、657 bp、511 bp、851 bp 片段。

结果判定：试验成立的条件下，根据电泳结果出现目的条带大小判定细菌的荚膜型。荚膜A型目的条带为 1 044 bp，B 型目的条带为760 bp，D 型目的条带为 657 bp，E型目的条带为511 bp，F型目的条带为 851 bp。

5.诊断结果判定。

（1）若临床症状符合禽霍乱临床诊断特性，分离鉴定检测结果或PCR检测方法结果为阳性时均可确诊。

（2）血清学检测方法检测结果为阳性时，可判定为禽只体内存在禽霍乱抗体。

（3）根据荚膜多重PCR检测方法的判定结果，可鉴定禽多杀性巴氏杆菌的荚膜型。