基因载体的性能改进及应用研究进展

李剑怡，王晞

(武汉大学人民医院，武汉 430060)

基因治疗作为一种治疗遗传缺陷和获得性疾病的潜在方法格外受到关注，它为癌症、某些自身免疫性疾病和单基因遗传病等的治疗提供了一种新的思路。基因载体是基因治疗能否成功的关键。理想的基因治疗载体应该是转染效率高、靶向性强、安全且易于大规模生产的。目前，广泛使用的基因载体包括病毒载体和非病毒载体。为了将这种创新的方法从实验室走向临床，学者们做了大量的努力，现将基因载体的性能改进及应用研究进展综述如下。

1 病毒载体

目前对于病毒载体的研究远远多于非病毒载体，因为病毒具有传送其基因组进入靶细胞进行转染的分子机制，这就使得病毒载体具有很高的转染效率。然而，大多数野生型病毒载体对机体都具有致病性，利用基因重组技术对其改造之后才能用于实验和临床研究。

1.1 病毒载体的性能改进

1.1.1 腺病毒载体的性能改进 腺病毒是一种没有包膜的DNA病毒，衣壳内是长约36 kb的线状双链DNA分子。腺病毒具有高转染效率和相对低的毒性，通过删除不同数量的基因可以不同程度的降低其免疫原性和扩展基因表达。早期的腺病毒载体中仅可以插入12 kb的基因片段，而通过删除腺病毒主干的整个蛋白质编码区后构建的无病毒基因的第3代腺病毒载体，则可以插入30 kb的基因片段，提高了载体的编码能力。在一项治疗黑色素瘤的研究[1]中，将表达IL-24的腺病毒载体与替莫唑胺结合，改变了黑色素瘤细胞中促进细胞凋亡与抗细胞凋亡蛋白的比例，提高了治疗效果。但是，许多人类腺病毒的中和抗体血清阳性率很高，其中血清5型腺病毒(Ad5)的中和抗体血清阳性率可高达80%，这就导致宿主识别和腺病毒载体的快速清除，影响了转染效率，增加了炎症反应的程度。此外，全身给药后，因为腺病毒衣壳对凝血因子和腺病毒受体的亲和力，Ad5和许多其他血清型腺病毒会迅速被隔离在肝脏中，也影响了转染效率。Sharon等[2]研究出了一种改进方法，通过使用嵌合型Ad5载体，将免疫表位和纤维衣壳蛋白的球状旋钮区域上的受体结合序列换成其他血清型的腺病毒(如Ad3、Ad35和Ad43)，提高了转染效率。研究[3]使用猴腺病毒替代人类腺病毒作为载体进行转染取得了良好效果，因为人类对猴腺病毒没有抗体，它的结构蛋白可用于制造嵌合型腺病毒。

1.1.2 腺相关病毒载体的性能改进 腺相关病毒属于微小病毒科，是一种结构简单、非致病的缺陷性病毒。腺相关病毒存在复制缺陷，往往需要一个辅助病毒，如腺病毒或者疱疹病毒，才能在生命周期中进行自我复制。因腺相关病毒载体在末端重复序列之间最多可携带4.5 kb的外源基因，故必须采取一些策略来增强其承载基因序列能力。其中一种方法是在两个不同的基因片段上导入目的基因和调控元件，通过反式剪接或者通过两个重叠序列同源重组在转基因转导后连接起来，使得包装容量得到提高，但是此种拼接方法生产效率较低。为了提高目的基因的表达效率，McCarty等[4]构建了一种双链互补腺相关病毒载体(scAAV)，scAAV的主干被设计成经过分子内碱基配对折叠的双链DNA，避免了单链DNA从头合成互补链的过程。随后，有研究[5]利用scAAV载体成功地将siRNA转染进入多重耐药的人乳腺癌和口腔癌细胞内，获得了比传统腺相关病毒更高的转染效率。

1.1.3 逆转录病毒载体和慢病毒载体的性能改进 逆转录病毒是一种RNA病毒，具有将其RNA整合到宿主细胞基因组后通过逆转录功能转化为双链DNA的特性,可以稳定地将遗传信息整合到宿主细胞的染色体上。目前，有关逆转录病毒的研究主要集中在鼠白血病病毒(MLV)上。上个世纪90年代，MLV在临床实验[6]中被用于治疗腺苷脱氨酶缺乏导致的严重复合性免疫缺陷症，结果20名患者中有5名患者患上了白血病。这一不良后果被认为是由于MLV基因整合到患者基因组从而产生插入突变，导致患者原癌基因激活，所以之后的研究都集中在削弱基因毒性上。其中一个方法是使用自灭活MLV载体(self-inactivating-MLV，SIN-MLV)，即删除MLV基因组长末端重复序列的增强子和启动子，导致整合后的载体不能转录完整长度的RNA。然而，SIN-MLV在造血干细胞中的转染率低于有完整长末端重复序列的MLV，使用替代的启动子可能会有效改善SIN-MLV的转染率，增加其临床效用。一项临床实验[7]表明，1名严重地中海贫血患者使用编码β-球蛋白的SIN-MLV体外转染的造血干细胞进行治疗，经过3年治疗后，这名患者可以维持血红蛋白在9.0～10.0 g/dL的范围内且不用输血，治疗效果良好。

MLV不能穿过核膜，因此感染仅限于发生核膜解体的有丝分裂细胞。而慢病毒则可以通过核孔进入细胞内，因此慢病毒能同时转染分裂细胞和非分裂细胞，这扩大了其在基因治疗应用中的适应性。研究[8]表明，作为一种慢病毒载体，人免疫缺陷病毒更倾向于整合到转录基因的下游区域，使得它们不易插入生长控制基因中使肿瘤生长，为肿瘤的治疗提供了新方法。慢病毒载体也已在临床上用于治疗白血病，研究[9]以慢病毒为载体对T细胞进行基因修饰，使其表面稳定地表达嵌合抗原受体，触发T细胞的激活，从而介导表达CD19的白血病细胞的特异性免疫应答。

1.2 病毒载体在基因治疗中的应用 大量的临床实验已经使用或者正在使用病毒载体进行基因治疗。研究[10]对17例可切除的结直肠癌、非小细胞肺癌、尿路上皮癌和肾癌的患者，静脉注射包装有肿瘤靶向嵌合腺病毒载体的药物，给药后第8～15天切除肿瘤，随后采用核病毒己酮免疫组化染色和病毒基因组DNA定量聚合酶链反应对肿瘤标本进行检测，结果表明在静脉注射后可观察到大多数肿瘤中有药物的存在，而正常组织中很少或没有，且80%的肿瘤样本中存在大量的CD8+细胞，可见这种病毒药物载体的给药方式可以驱动机体的免疫反应。

为了利用腺相关病毒载体传递微小基因片段，研究者发明了双腺相关病毒技术。双腺相关病毒技术中完整的基因编码序列被分成两部分，分别由一个腺相关病毒载体传递，这两个腺相关病毒载体共同转染细胞后将基因表达重组。在杜氏肌营养不良犬模型实验[11]中，研究者使用一对包装了能表达7 kb犬H2-R15迷你营养不良蛋白基因的双腺相关病毒载体转染犬的尺骨腕伸肌，其结果是广泛的微营养不良蛋白表达、营养不良蛋白相关糖蛋白复合物的恢复，可减少肌肉退行性变。

溶瘤病毒并不是一种特定的病毒，而是一类倾向于感染肿瘤细胞并能在肿瘤细胞内大量增殖，最终使肿瘤细胞裂解死亡的病毒。单纯孢疹病毒相较于其他病毒具有能感染多数肿瘤细胞系的特征，所以溶瘤性单纯疱疹病毒-10载体已在复发性乳腺癌、无法切除的胰腺癌、难治性浅表癌和黑色素瘤中进行了临床实验。研究[12]表明，溶瘤性单纯疱疹病毒-10和易普利姆玛联合治疗在二期临床实验中表现出良好的安全性和抗肿瘤疗效。包含一个单链RNA基因组的柯萨奇病毒A21作为一种新兴的溶瘤病毒也积极用于癌症治疗的研究[13]中，在黑色素瘤患者中的Ⅰ/Ⅱ期临床实验中显示出良好的耐受性，肿瘤中病毒复制和抗肿瘤的活性显著增加。

2 非病毒载体

非病毒载体系统不断优化，现在已经研究出了许多化学载体用于基因传递，如阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们可以与带负电荷的DNA形成载体复合物，载体复合物通过细胞内吞或膜融合的方式将DNA导入细胞内，完成基因传递。非病毒载体进入细胞后还要经过核内体释放、穿越细胞质和进入细胞核整合基因等过程，人们通过调整这些化学载体的分子结构、分子量、表面电位或结合其他生物功能单元等方式，努力提高其基因传递效率，降低其毒性，为用于临床治疗打下基础。非病毒载体除了可以传递质粒DNA之外，还能传递合成的化合物，如寡核苷酸和siRNA。与病毒载体相比，非病毒载体有很多优点，一方面非病毒载体作为治疗基因的传递工具，通常使用天然的或合成的化合物，所使用的材料毒性较低、免疫原性低且部分材料具有生物可降解性，大大提高了其作为基因治疗载体的安全性；另一方面人们在设计载体时可以进行化学修饰，如将特异性分子偶联在载体表面，利用靶向配体这一特性来实现载体的细胞或者组织特异性。非病毒载体还有易于生产、成本较低和有重复使用的可能性等优点。

2.1 非病毒载体的性能改进

2.1.1 提高非病毒载体的细胞外稳定性 非病毒载体一旦进入细胞外环境就必须保持其结构的完整性，以实现与靶细胞的接触。机体内的网状内皮系统能阻止大分子直接进入靶细胞，Kupffer细胞和巨噬细胞等吞噬细胞会清除通过血液循环输送的含有DNA的外源性颗粒。研究[14]发现，在非病毒载体制备过程中加入聚乙二醇，有助于非病毒载体避免被解剖屏障和细胞屏障的清除，因为聚乙二醇具有亲水性，还可以屏蔽一定数量的正电荷。此外，全身静脉注射无包被的基因片段会被血液和细胞外基质中存在的各种核酸酶迅速降解成游离的核酸。由阳离子脂质体或阳离子聚合物组成的复合体能促进基因传递复合物与靶细胞的静电作用，压缩基因遗传载荷，防止其降解。研究[15]以超分支化的聚醚酰亚胺为亲水壳、以含硅氧烷的单元为疏水核，利用亚胺键的可逆性和疏水性相互作用获得了具有球形形态的非病毒载体，结果表明，这种化合物有很强的结合DNA的能力，且在Hela细胞上具有高转染效率。

2.1.2 提高非病毒载体的细胞摄取效率 核酸通常情况下不能通过细胞膜，我们可以用基因枪、电穿孔等物理方法创造一个瞬态孔，或者利用大分子吞噬作用、内吞作用及胞饮作用等各种细胞吸收机制，使核酸通过细胞膜。非病毒载体的传递几乎都涉及到内吞作用，其中核内体发挥了重要作用。核内体是一个具有运载功能的囊泡结构，为细胞外物质进入细胞内提供了运载途径。但是，核内体会将捕获的大分子转化为消化溶酶体并降解，故非病毒载体通过内吞作用进入细胞后必须从核内体中逃逸出来才能转染细胞。研究[16]将阳离子复合物与核内体膜上的阴离子结合，形成中性离子对，最终破坏核内体膜并促进阳离子复合物的分解。另一种研究[17]是利用核内体室内产生的渗透压差，引发核内体小泡的肿胀和破裂，使非病毒载体从核内体中逃逸出来。大分子量蛋白质的核摄取是一种通过输入蛋白特异性识别并结合具有核定位信号肽(NLS)的转运蛋白的主动转运过程，在一项研究[18]中，猿猴病毒的NLS通过加帽作用附着在线性质粒的一端，用这一质粒与聚醚酰亚胺混合后转染细胞，可以将基因传递到细胞核的效率提高8倍。

2.1.3 保持非病毒载体治疗基因的表达水平 治疗基因的表达水平取决于驱动其表达的启动子类型。用于驱动基因表达的启动子根据来源可分为病毒启动子和组织特异性启动子。研究[19]表明，尽管使用组织特异性启动子可能有利于靶向转录，但由于基因转录水平低，它们的效用有限。组织特异性启动子与增强子和内含子联合使用，大大提高了治疗基因的表达水平。研究[20]结果显示，受体细胞在转染的过程中可能因为受损而死亡，转染细胞由于暴露于转染剂或DNA降解产物中也可发生细胞凋亡。此外，许多基因启动子区通常存在一些富含双核苷酸CG的区域，这一区域的DNA CpG甲基化也可能导致基因沉默。研究[21]发现，免疫系统具有识别细菌DNA CpG非甲基化的能力，免疫细胞可以通过释放细胞因子导致炎症，因此结合无CpG的质粒主干和无CpG的启动子可能会使基因治疗成功。

2.2 非病毒载体在临床前实验中的应用 基于非病毒载体的治疗已不断的被用于临床前实验。一项临床前实验[22]用包装有治疗基因的非病毒载体转染肝脏细胞，发现目的基因序列中增加了肝脏基因座控制区、内含子和未翻译区域，这可以提高和稳定肝脏产生的用于凝血的Ⅸ因子基因在体内的表达，对血友病的基因治疗有重大意义。局部注射的给药方式在模拟大鼠疾病治疗中显示出了一些显著的效果。基质细胞衍生因子-1是一种自然发生的趋化因子，在组织损伤时能迅速产生，促进组织损伤部位血管的发育。研究[23]将包含编码基质细胞衍生因子-1基因的非病毒载体局部注射到大鼠心肌梗死的部位，结果发现，大鼠心功能显著改善、心血管密度显著增加。非病毒载体在肿瘤的基因治疗领域也应用广泛。Sharma等[24]利用一种含有乳酸-钴-乙醇酸的纳米颗粒转运p53基因治疗鼠的前列腺癌，取得了一定的效果。研究[25]构建了一种微环DNA载体，用来传递双特异性抗体，使T细胞能够杀死B细胞淋巴瘤。这些研究结果表明，基于非病毒载体的基因治疗具有一定的潜力，在不断改进非病毒载体的结构和功能、研究针对不用疾病的给药方式、提高细胞和组织靶向性后，可望在不久的将来进入临床。

总之，基因治疗本质上是一个目的基因、载体和转染的问题，基因载体是基因治疗成功的关键。常用的腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒及慢病毒等病毒载体通过删除具有致病性的基因片段，在合适的位置插入治疗基因，增加了其安全性，并越来越为临床所用。阳离子脂质体、阳离子聚合物等非病毒载体在基因序列中加入启动子后也大大提高了转染效率。可见，无论是病毒载体还是非病毒载体都向着理想载体的目标不断改进。随着有关基因载体研究的逐渐深入，以载体为基础的基因治疗也取得了一定的成果，如利用病毒载体将致死性基因导入肿瘤细胞以杀死肿瘤细胞，利用溶瘤病毒载体使肿瘤细胞破裂、降解治疗肿瘤，利用载有基质细胞衍生因子-1基因的非病毒载体局部给药治疗心梗等。基于基因载体的基因治疗已经有了长足的发展，并且正在成为现代临床治疗的关键方法。