饲 料 霉 菌 毒 素 生 物 降 解 研 究 进 展

张俊楠 王金全 杨 凡 刘 杰 吕宗浩 郑云朵

（中国农业科学院饲料研究所 新饲料资源开发与利用创新团队，北京100081）

1 霉菌毒素简介

1.1 黄曲霉菌素

黄曲霉菌素是由二氢呋喃香豆素衍生而来的，它难溶于水，易溶于氯仿、甲醇和丙酮等有机溶剂。截止到2015年己经检测到的黄曲霉毒素类型有二十余种，根据发光颜色、结构及性质分别命名为B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q1、H1、毒醇、GM等[1]。它具有致突变、致癌和致畸的毒性作用，同时黄曲霉菌素作为目前世界公认的天然毒性最强的物质之一，广泛存在于玉米、豆类、花生等粮食作物及奶制品、植物油等动植物产品中。在所有被研究的物种中，黄曲霉毒素病的主要临床效应都与肝损伤有关。黄曲霉毒素及其代谢产物可在动物产品以及一些食品中残留，并通过食物链危害到人类的健康。所以对饲料和食品中的黄曲霉毒素含量制定严格的标准是世界各国首要做到的，国际卫生组织(WHO)/世界粮农组织所属的食品法典委员会(CAC)推荐食品、饲料中黄曲霉毒素最大允许量标准为总量(B1+B2+G1+G2)小于15 μg/kg。其中美国规定奶牛饲料中的AFT总量(B1+B2+G1+G2)不得超过20 μg/kg，其它动物饲料中不得超过30 μg/kg。

1.2 呕吐毒素

呕吐毒素主体成分为脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON），属于单端孢霉烯族化合物。脱氧雪腐镰刀菌烯醇主要由镰刀菌属产生，是谷物中最常检测到的单端孢霉烯污染物之一。摄入低剂量或中等剂量的DON 会导致恶心、腹泻、胃肠道病变、营养效率降低和动物体重减轻等现象。较高剂量的DON诱导呕吐和拒食，严重减轻体重，严重损害造血系统和免疫失调[3]。在所有物种里，猪是受DON影响最严重的动物。我国饲料卫生标准中也对动物饲料中呕吐毒素的含量由严格的规定：猪配合饲料≤1 mg/kg，牛配合饲料≤5 mg/kg，犊牛配合饲料≤1 mg/kg，家禽配合饲料≤5 mg/kg，泌乳期动物配合饲料≤1 mg/kg[4]。

1.3 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮（ZEA）是一种由6-（10-羟基-6-氧代-反式-1-十一碳烯基）-β-间苯二甲酸内酯组成的非甾体雌激素霉菌毒素。ZEA由镰刀菌属中的各种菌株产生，含量最多的是禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），黄色镰孢（Fusarium culmorum）和禾谷镰孢（Fusarium cerealis）[5-6]。产生玉米赤霉烯酮的几种镰刀菌，特别是禾谷镰刀菌和粗毛镰刀菌，与雌激素受体竞争结合，导致人类和动物的生殖障碍和雌激素样功能障碍[7-8]。在急性中毒的条件下，对心脏、肾脏、神经系统、肝和肺都会造成危害。各国对饲料玉米赤霉烯酮限定的含量不尽相同，如欧盟规定仔猪日粮中ZEA 的最高限量为100 μg/kg，中国《饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量（GB13078.2—2006）》规定配合饲料和玉米中的ZEA最高含量为500 μg/kg[4]。

1.4 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素主要由曲霉菌和青霉菌产生，曲霉属在高湿度和高温条件下产生赭曲霉毒素，而一些青霉菌属可能会在低至5 ℃的温度下产生赭曲霉毒素。其中赭曲霉毒素A毒性最强，赭曲霉毒素A是由几种曲霉属和青霉属产生的聚酮化合物。它在动物中具有强烈的肾毒性，致畸性，胚胎毒性，免疫毒性和神经毒性[9]，并且国际癌症研究机构（IARC）将其确定为可能的人类致癌物（2B 组）[10]。赭曲霉毒素A 的化学结构是7-羧基-5-氯-8-羟基-3,4-二氢-3-R-甲基异香豆素，它的7-羧基与L-β-苯丙氨酸通过酰胺连接键。该分子在高温下非常稳定并且耐水解[11]，因此，用于食品和饲料目的的原料的一般加工不能除去赭曲霉素A，在最后的产品中会留下毒素。中国GB 2761—2011 规定谷物、豆类及其制品中OTA 的允许量不得超过5 μg/kg[4]。

1.5 伏马菌素

伏马菌素(Fumonisin FB)是一种霉菌毒素，是由串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme Sheld）产生的水溶性代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物[12]。该化合物是2-氨基-12,16-二聚体多羟基二十烷二酯和丙烷-1,2,3-三羧酸，其中C14和C15被羧酸的羟基酯化[13]。其特征为三羧基氨基多元醇，它们会引起毒性，诱导马脑损伤，猪肺水肿，家禽免疫抑制和大鼠肝脏致癌性[14-16]。之前的研究还报道了其他动物的肾病，血栓形成，动脉粥样硬化和中毒[16-17]。在人类中，它天然形成与南非和中国的食管癌相关[18-19]。

通过上述介绍了五类霉菌毒素的毒性以及限量，发现寻找霉菌毒素的去除方法是很重要的，也是众多学者都在关注的问题。现在存在的一些去除方法主要有物理法、化学法及生物降解。综合比较各种方法，最为常用的主要为物理吸附法和生物降解法。但是，大多数试验证实吸附剂仅对饲料中一种毒素有明显效果，而对其他种类毒素吸附效果不明显，而且，现在大多数饲料中均为多种毒素共同污染，吸附方法太过单一，同时吸附剂最终又将饲料中的霉菌毒素转移到了环境中，给环境造成二次污染。与这种具有有限的功效和影响成本的去除方法相比，霉菌毒素的生物解毒，使用微生物和/或酶将霉菌毒素降解为无毒或毒性较低的化合物，这种方法具有效率高、特异性强，对饲料和环境无污染等特点与优势。

2 霉菌毒素的生物降解

霉菌毒素有着如此强的毒性，是因为它自身结构中的某个或某些基团的存在，如黄曲霉毒素的毒性与它分子结构中的双呋喃环和氧杂萘邻环有关系；呕吐毒素分子结构中C-9，10位的双键和C-12，13位上的环氧环与它的毒性有很大的关联性等。生物降解法就是一种绿色环保、安全的彻底去除霉菌毒素的方法，它利用自然界存在的微生物或其代谢产物，在微生物自然生长繁殖过程中将霉菌毒素分子结构中的关键基团破坏，生成无毒安全的代谢产物，从而降解掉霉菌毒素，在根本上解除霉菌毒素对动物和人类的危害[20]。

随着对大量学者对霉菌毒素研究的不断深入，现在已经发现许多具有特异性降解霉菌毒素的能力的微生物。

2.1 细菌降解霉菌毒素

许多研究发现，一些细菌具有较强的降解霉菌毒素的能力。计成[21]报道，分枝杆菌、橙色黄杆菌、芽孢杆菌以及红珠串红球菌等能有效降解霉菌毒素，且进一步研究发现，主要降解成分为代谢酶，这些代谢酶是细菌生长繁殖过程中产生的[21]。

2.1.1 细菌降解黄曲霉毒素（AF）

崔玉琦等从非洲象粪中分离出短小芽孢杆菌E-1-1-1 菌株，采用单因素法和正交试验优化降解条件，碳源是麦芽糖（0.6%），氮源是酵母粉（1%）。在pH 值为6，培养温度为37 ℃，接种量为3%的优化条件下，对AFM1的降解率可达到92.5%[22]。

Kong 等[23]采用Plackett-Burman 设计和中心复合设计筛选关键因子，确定R. erythropolis 降解AFB1的最佳条件，最终AFB1降解效率从28.7%提高到95.8%。

据报道，在营养肉汤培养基中37 ℃培养72 h后，绿脓杆菌N17-1可使AFB1、AFB2和AFM1降解82.8%，46.8%和31.9%[24]。

Shu G 等[25]使用香豆素作为筛选具有AFB1还原活性的细菌分离物的唯一碳源。他们发现，从37 ℃的液体培养基中培养72 h后，从貘粪中获得的嗜麦芽寡养单胞菌35-3可使AFB1降低82.5%。其培养液能够有效降解AFB1，而活细胞和细胞提取物的效果则差得多。用蛋白酶K处理，蛋白酶K加SDS和加热处理显著降低或消除了培养液的降解活性，表明嗜麦芽窄食单胞菌35-3对AFB1的降解是酶促的。

2.1.2 细菌降解呕吐毒素（DON）

Shima等[26]推断DON中的3-OH基团可能参与发挥其免疫抑制毒性。通过富集培养程序从土壤样品中获得土壤杆菌-根瘤菌菌株E3-39。菌株E3-39可以氧化DON 的3-OH 基团以产生3-酮-4-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-酮基-DON），其对于DON表现出显著降低（至小于十分之一）的免疫抑制毒性。

从麦田收集的土壤样品中分离的细菌Nocardioides WSN05-2 降解DON 产生新的中间体3-epi-DON。3-epi-DON 是DON 的差向异构体，其在3-OH基团的立体化学中与DON不同[27]。

最近，He J W等[28]从农业土壤中筛选出一株变形虫Devosia mutans 17-2-E-8。该细菌能够将DON 转化为3-epi-DON（主要产物）和3-酮-DON（次要产物）。通过体外和体内研究证明代谢产物3-epi-DON的毒性低于DON。

2.1.3 细菌降解玉米赤霉烯酮（ZEA）

已经报道了一些关于细菌对ZEA 的生物转化的研究，这些研究中的菌株包括猪的细菌肠道菌群[29]，混合培养物[产碱杆菌、芽孢杆菌、无色杆菌、黄杆菌和假单胞菌（Pseudomonas）[30]、不动杆菌属（Acinetobacter sp.）[31]]等。

Cserhati 等[32]报道了三种红球菌属物种，R.erythropolis、R.ruber和R.pyridinivorans都具有＞50%的ZEA降解能力，其中R. pyridinivorans菌株是最有效的降解物，效率为70%。

Tan等[33]从腐殖黑泥土壤和发霉的土壤中分离出两种ZEA降解菌，命名为P. alcaliphila TH-C1和P. plecoglossicida TH-L1，当孵育72 h后，它们对ZEA（2 μg/ml）的降解率分别约为68%和57%。

Wang J Q等[34]在鸡大肠消化物中分离的菌株ZJ-2016-1的纯培养物，显示出有效降解玉米赤霉烯酮毒素的作用。通过16S rRNA基因序列分析方法鉴定其菌株为赖氨酸芽孢杆菌。利用ZJ-2016-1的全细胞，在48 h 内降解了Luria-Bertani 培养基中的32 μg/ml ZEA。

2.1.4 细菌降解赭曲霉毒素（OTA）

到现在已经报道了许多具有不同降解或吸收赭曲霉毒素A 的能力的微生物，包括降解100%赭曲霉毒素A的短杆菌（Brevibacterium spp.strain）[35]，枯草芽孢杆菌细胞结合超过60%的赭曲霉毒素A，无细胞上清液也降解97.6%[36]。从土壤中分离出的醋酸钙不动杆菌和不动杆菌属，在24 ℃下6 d后分别降解82%和91%的赭曲霉毒素A成为赭曲霉毒素α[37]。

一些芽孢杆菌和乳酸杆菌菌株被证明可以消除0.05 mg OTA/l，将其添加到培养基中，特别是保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别淘汰OTA 为94%、72%、46%、68%和39%[38]；据报道，植物乳酸菌，短乳杆菌和L. sanfrancisco在孵育24 h 后分别消除了0.3 mg OTA/l 的54%、50%和37%[39]。现在普遍认为，OTA对细胞壁的吸附是乳酸菌（LAB）在这种OTA 解毒现象中所涉及的主要机制。

2.1.5 细菌降解伏马菌素（FB）

Tuppia C M 等[40]使用伏马菌素自然感染的两个种植年份的体外模拟青贮饲料模型，他们首次证明了高水分玉米青贮过程中FB1 含量的下降，文中写到，在青贮饲料B的发酵过程中，观察到游离FB1含量急剧下降，141 d 后达到93%。对于青贮饲料D 和C，该过程结束时游离FB1 损失的百分比分别达到41%和38%。这种伏马菌素减少可通过微生物降解活动而非基质结合机制来解释。从该基质中分离出9种FB1降解微生物。值得注意的是，两种细菌分离株，短乳杆菌N195和短乳杆菌N197的降解作用尤为重要。

Camilo S B等[41]从玉米和青贮饲料中分离微生物，分离株S9、S10、S69为孢子杆菌，分别降低初始FB1浓度的43%、48%和83%。在生物降解过程的培养期间，培养基中的pH值逐渐增加，可能是由于伏马菌素分子骨架中C2氨基的释放在解毒过程中起着重要作用。

2.2 真菌降解霉菌毒素

2.2.1 真菌降解黄曲霉毒素

国内最早研究黄曲霉毒素生物降解的是暨南大学刘大岭研究小组，他们发现一种从真菌假密环菌(Armillar-iella tabescens)中提取的粗酶液可使样品中的黄曲霉毒素B1含量减少80%。活性物质解毒作用的pH值、温度、时间等特征表明，是粗酶液中的一种胞内酶在起解毒作用。之后，他们从假蜜环菌的菌丝提取物中分离纯化出此解毒酶基因，利用克隆方法得到其基因序列并在毕赤酵母表达系统中成功转化了[42]。

Wei Z等[43]筛选了一种黑曲霉（ND-1）菌株，其在发酵48 h 后可以降解58.2%的AFB1。黑曲霉的降解活性在培养上清液中明显强于细胞和细胞提取物，并受热处理、温度、pH 值和金属离子的影响，表明降解反应是酶促的，该过程主要发生在细胞外环境中。

Nakazato M 等[44]研究了潜伏期对赤散囊菌将AFB1转化为AFL 的影响。培养物中AFL 的积累在第2 d开始，在第6 d和第8 d之间迅速增加，然后在培养期结束的第15 d逐渐减少。

2.2.2 真菌降解呕吐毒素

据报道，生长的雪腐镰刀菌乙酰化DON 提供少量的3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇[45]。从土壤中分离出的真菌曲霉菌NJA-1表现出降解DON的能力并且其生物转化代谢物的分子量比DON 大18.1D（H2O），表明DON可以被NJA-1水解[46]。

2.2.3 真菌降解玉米赤霉烯酮

研究发现，可使ZEA 的内酯环打开的真菌有粉红粘帚霉（Gliocladium roseum）和解毒毛孢酵母（Trichosporon mycotoxinivorans），它们使玉米赤霉烯酮降解为无毒代谢产物。并且，粉红粘帚霉的代谢产物内酯水解酶，同样也可作用于ZEA的内酯环，使其转化为无雌激素效应的代谢产物，然后排出体外。现已发现，自然界存在的真菌如酿酒酵母、解毒毛孢酵母等，都可以特异性降解DON和OTA[20]。

Vekiru E 等[47]已经研究了解毒毛孢酵母的ZEA代谢物。作者报道了名为ZOM-1 的新型ZEA 代谢物，其特征是在C6'的酮基上开放了ZEA的大环，并鉴定为（5S）-5-{2,4-二羟基-6-[（1E）-5-羟基戊-1-烯-1-基]苯甲酰基}氧基）己酸。ZOM-1代谢物在体内不是雌激素，并且在体外不与雌激素受体蛋白相互作用，表明ZOM-1雌激素的丧失。

还发现玉米赤霉烯酮被几种根霉菌属分离株完全降解，包括葡颈根霉菌、稻根霉菌和小孢根菌株。Elsharkawy 等证明无根根霉菌（IFO-6155）可以催化ZEA 在C-4 羟基上的硫酸化，形成一种新的代谢物，确定为ZEA-4-O-硫酸盐结合物[48]。同样，黑曲霉能够通过磺化使ZEA解毒，形成毒性较低的化合物[49]。

2.2.4 真菌降解赭曲霉毒素

Bejaoui 及其合作者证实了酿酒酵母对OTA 的吸附，他们证实热和酸处理的细胞可以比活体细胞更多地更显著地结合OTA。活力酵母结合OTA 的35%和45%，取决于培养基和菌株，而热和酸处理的细胞最多结合75%[50]。另外，据报道酵母在酒精发酵过程中减少OTA，例如酿造或酿造。在麦汁发酵过程中，酵母吸附的OTA最多可吸收21%[51]。此外，在与大量生物的酵母长期接触后，几乎30%的添加的OTA 被去除[52]。Cecchini 等[53]在葡萄酒酿造试验中证实，高达70%的OTA可以从葡萄酒中去除，并且在酵母渣中发现了大部分去除的OTA。

毛孢子菌属，红酵母和隐球酵母通过裂解酰胺键和释放OTα证明了生物降解OTA 的能力[54]。在该研究中，在35 ℃温育5 h 后，最有效的菌株降解至0.2 mg OTA/l 的100%。由于其优异的OTA 和玉米赤霉烯酮解毒能力，该酵母随后被归类为新型解毒毛孢酵母[55]。红发夫酵母菌株在20 ℃下15 d后也能够降解90%的7.5 mg OTA/l[56]。在这项研究中，作者能够验证OTA 向OTα的转化以及OTA 在活细胞和热处理细胞中的吸附。

在30 ℃温育10 d后，烟曲霉、日本曲霉和黑曲霉降解2 mg OTA/l[57]。

2.2.5 真菌降解伏马菌素

Camilo S B 等从玉米和青贮饲料中分离出了一株名为SE3071 的酵母，它可降低57%的初始FB1 的浓度[41]。在通过45 ℃加热浓缩醇提取物期间抑制SE3071 的活性丧失，酵母产品的不稳定性可能是由于作为“杀手”因子产物的拮抗活性的表达，由有毒的消化性化合物构成[58-59]。

2.3 酶制剂降解霉菌毒素

2.3.1 酶制剂降解黄曲霉毒素

一种来自变色栓菌（1 U/ml）的纯漆酶在孵育72 h后可以使AFB1降解87.34%[60]。Zeinvandlorestani H 等发现，最佳酶促反应发生在0.1 mol/l柠檬酸盐缓冲液中，该缓冲液含有20%DMSO，温度为35 ℃，pH值为4.5，漆酶活性为30 U/ml；两天后，67%的AFB1被移除[61]。

同样，Yehia R S 从白腐菌菌Pleurotus Oostreatus漆酶中纯化了MnP，最终酶活力达到81 U/ml，比活力达到78 U/mg。在1.5 U/ml酶活性下孵育48 h后观察到最高的解毒能力（90%）[62]。

Zhao L H等[63]从细菌橙色粘球菌ANSM068制备并纯化了称为粘细菌黄曲霉毒素降解酶（MADE）的细胞外酶，最终比活性为569.44×103U/mg。纯酶（100 U/ml）在培养48 h 后表现出对AFG1(96.96%)和AFM1(95.80%)的高降解能力。酶MADE在5.0至7.0的宽pH值范围内以及30～45 ℃的温度下表现出高活性。

2.3.2 酶制剂降解呕吐毒素

DON 中单端孢霉烯环的3-O-乙酰化导致其失活。对编码来自禾谷镰刀菌的单端孢霉烯-3-O-乙酰转移酶的基因tri101进行了表征[64]。

Khatibi 等科学家克隆了来自七种镰刀菌种的单端孢霉烯3-O-乙酰转移酶基因，并比较了它们的性质，以确定用于生物技术应用的酶的最佳来源[65]。

2.3.3 酶制剂降解玉米赤霉烯酮

Yu Y 等从细菌不动杆菌sp.SM04 液体培养物的细胞外提取物中分离酶，并获得能够有效降解ZEA的活性级分。活性部分可以将ZEA 降解为较小的雌激素产物，并且发现两种中间产物ZEN-1 和ZEN-2，这表明玉米赤霉烯酮的苯环可以被裂解并氧化成含有羧基的产物。此外，分析活性部分中的酶，发现三种蛋白质。它们被鉴定为过氧化物酶，一种可能的细胞色素和光滑的菌毛蛋白前体[66]。

Takahashiando N等纯化了真菌C. rosea中的新型内酯水解酶，其负责ZEA的解毒，然后克隆编码基因，命名为zhd101。在pH值10.5下观察到在大肠杆菌中表达的重组ZHD101蛋白对ZEA的最大活性，具有极低的摩尔活性（在30 ℃下kcat=0.51/s）[67-68]。

2.3.4 酶制剂降解赭曲霉毒素

首次报道的能够水解OTA 的蛋白酶是来自牛胰腺的羧肽酶A（CPA）（EC 3.4.17.1）[69]。随后，一项包括几种水解酶的筛选研究证实，来自黑曲霉的粗脂肪酶产品能够通过酰胺键水解OTA[70]。通过阴离子交换色谱法纯化酶，证明其裂解OTA并产生一种特定地脂肪酶底物——对硝基苯基棕榈酸酯。

还报道过一种无黑曲霉细胞的粗酶制剂的生产和纯化，该酶制剂显示出显著的切割OTA酰胺键的能力。所涉及的OTA 降解酶通过阴离子交换色谱法纯化并表征[71]。该酶在pH 值7.5 和37 ℃下显示出比CPA更高的OTA降解活性，并且被EDTA抑制。

在随后的研究中，发现来自酿酒酵母的羧肽酶Y（CPY）（EC 3.4.16.1）也能够在pH 值5.6 和37 ℃下以最佳活性水解OTA[72]。

2.3.5 酶制剂降解伏马菌素

细菌ATCC 55552 和S.macrogoltabidaMTA144 的降解通过羧酸酯酶的脱酯化和随后通过氨基转移酶对水解的伏马菌素（HFB1）的脱氨作用实现，形成2-酮基HFB1[73]。通过使用简并聚合酶链反应（PCR）引物，反向PCR和基因步移技术测定编码这些酶的微生物基因序列。通过使用附加型pET-3a 载体，分别在巴斯德毕赤酵母和大肠杆菌中表达S.macrogoltabidaMTA144和细菌ATCC 55552的羧酸酯酶（FumD）和氨基转移酶（FumI）；利用异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷在液体培养物中诱导重组酶的产生，其中用重组培养上清液和纯化的酶制剂证明FB1和HFB1的降解。

虽然这些技术中的某些技术被欧洲食品安全局（EFSA）认为对人类，动物和环境是安全的，但微生物酶的应用目前主要针对动物饲料工业[74-76]。重组酶在生物反应器中大量生产，并在储存和食品加工过程中进行应用，以掺入动物饲料中并作用于动物肠道，或用于洗涤，添加剂或喷雾形式的谷物处理。

3 霉菌毒素生物降解的研究现状及发展趋势

到现在为止，市面上已经出现了很多关于生物降解霉菌毒素的产品，这说明霉菌毒素的生物降解已经有了很大的进展，但它们在食品和饲料的解毒实践中仍然受到了限制。这是因为真菌的实际应用可能受到诸如获得活性提取物所需的复杂程序，解毒所需的长孵育时间和不完全解毒过程等因素的限制。

但细菌降解的高降解速率和广泛的反应条件意味着霉菌毒素降解是很有潜力和希望的应用。使用创新的技术和策略，如富集、高选择性培养基、PCRDGGE 细菌谱和有效的分子技术，就可以增加从复杂的微生物区系中选择目标微生物的机会。开发关注益生菌的研究也很有意义，益生菌可以直接应用于饲料和饲料中。此外，活性酶的使用也是霉菌毒素降解的好方法。许多具有一定功能的酶，如植酸酶，已经从发酵液中纯化出来，并成功应用于食品和饲料工业。在这方面，可以通过酶的制备和纯化，编码酶的基因的鉴定和重组酶的过表达来开发用于有效解毒真菌毒素的酶产物。同时，我们仍然需要深入研究生物降解机制，降解产物结构以及微生物和降解产物对动物的安全性，以支持微生物在食品和饲料工业中的应用。