三种同型发酵乳酸菌混合培养的发酵特性及对黄曲霉抑菌作用的研究

田亚东 邹 旸 韩琳洁 刘 正 郝东升 钟 成 彭传文 范 寰

（1.天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室，天津300457；2.天津嘉立荷牧业集团有限公司，天津300402；3.天津市畜牧兽医研究所，天津300381）

黄曲霉是一类生命力极其顽强的腐败微生物[1]，在动物饲料中生长会导致对人体和动物的伤害，同时也是在饲料储存、贮藏过程中引起饲料腐败霉化的主要污染源之一。国内外对如何抑制黄曲霉生长进行了大量研究，如热处理、红外线处理等物理方法，添加乳酸、苯甲酸等添加剂的化学方法等，但随着实际应用，这些传统方法尚未证明是经济有效可行的[2-3]。研究和开发绿色饲料添加剂产品，已经成为世界性的研究课题。目前国内外研究表明，部分乳酸菌对黄曲霉的生长和毒素的形成有一定的抑制作用[4]。植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌三者均为同型发酵乳酸菌[5]。在发酵过程中的代谢产物如有机酸和细菌素等物质均对杂菌有一定的抑制作用，可作为天然绿色的生物防腐剂[6]。王丽学等[7]前期研究表明凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌和乳酸片球菌复合微生物菌剂能有效提高全株玉米青贮品质。本研究以这三种菌及其混合培养液为研究对象，研究这三种同型发酵乳酸菌及混合培养液对黄曲霉的抑菌作用，以期为饲料微生物添加剂的研制提供指导依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株：植物乳杆菌lactobacillus plantarumACCC11016 购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心；乳酸片球菌Pediococcus acidilacticiCGMCC 1.4购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；凝结芽孢杆菌Bacillus coagulansACCC10229购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心；黄曲霉菌Aspergillus flavusCICC NO.2219 购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

培养基：MRS 培养基（Modified MRS Medium Base，MRS）购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；马铃薯葡萄糖（PDA）固体培养基：马铃薯200 g，琼脂8 g，溶于1 L去离子水，121 ℃灭菌20 min，参考张国华[8]所描述的配方配制。

试验仪器：LRH-250A 生化培养箱，由韶关市泰宏医疗器械有限公司生产；HNTC-2027 恒温培养振荡器，由天津欧诺仪器股份有限公司生产；SBA-40E 生物传感分析仪，由山东省科学院生物研究所生产；UV-6100 紫外可见分光光度计，由上海美谱达仪器有限公司生产；常规试剂及仪器由本实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化

用无菌接种环从冻存管中取出植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌，分别于MRS 固体斜面上划线，置35 ℃培养箱中培养至出现菌落，如此活化2次后挑取单菌落接于MRS液体培养基中35 ℃，120 r/min培养过夜，备用。

1.2.2 生长曲线、pH 值以及发酵液葡萄糖残留量（RG）的测定

分别将活化好的植物乳杆菌、乳酸片球菌、凝结芽孢杆菌和三种菌株以OD600nm值1:1:1 比例的混合菌按10%（v:v）接种量接于MRS 液体培养基中，35 ℃，120 r/min 培养24 h，培养期间定时取样测定菌液的OD600nm吸光度、pH 值和RG 值，绘制各菌株生长曲线、pH 变化曲线和RG 变化曲线，以观察各菌种单独培养及混合培养的生长变化，每组试验3 个重复。

1.2.3 菌种的平板计数

将上述活化后的植物乳杆菌、乳酸片球菌、凝结芽孢杆菌及混合培养的菌液用0.85%(w:v)的无菌PBS缓冲液分别稀释至10-7、10-8、10-9、10-10后进行涂布，35 ℃培养过夜，进行菌落计数，每组试验3个重复。

1.2.4 抑菌试验

1.2.4.1 黄曲霉孢子悬液的制备及指示菌浓度的确定

将黄曲霉接种在PDA 平面培养基上，在30 ℃培养箱内培养4 d后，加入一定量的无菌PBS 缓冲液刮取斜面上的孢子，将黄曲霉菌孢子洗下，收集到离心管中，用无菌的PBS 缓冲液洗涤3 次后，再用无菌纱布过滤3 次除去黄曲霉菌孢子的菌丝，进行血球计数板计数。将孢子悬液浓度调整为103、104、105、106、107孢子/ml，涂布到PDA平板上30 ℃培养[9]。

1.2.4.2 发酵上清浓缩液的制备

将上述活化后的植物乳杆菌、乳酸片球菌、凝结芽孢杆菌及混合培养的菌种接种到MRS液体培养基中35 ℃、120 r/min培养24 h后测定pH值，在4 ℃、10 000 r/min下离心15 min，取上清液，用酸度计测量其pH值，然后将上清液旋蒸浓缩10倍，待用。

1.2.4.3 抑菌活性的测定

抑菌实验采用琼脂扩散法进行测定，取指示菌孢子悬液100 μl（每个平板约含106个孢子）与经融化后保持在45 ℃左右的PDA半固体培养基混匀后倒入平板上，凝固后用内径8 mm打孔器打孔，分别将100 μl植物乳杆菌、乳酸片球菌、凝结芽孢杆菌及混合培养的上清浓缩液注入孔中，于4 ℃水平放置预扩散24 h后30 ℃培养12 h 测量其抑菌圈直径，每组试验3 个重复[10-11]。

1.3 数据处理与分析

数据分析和图表制作分别由IBM SPSS statistic 20.0 和Microsoft Excel 2010 完成，数据均以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 菌种的生长曲线

图1 植物乳杆菌、乳酸片球菌、凝结芽孢杆菌及混合培养的生长曲线

图1 可见，从植物乳杆菌的生长曲线图可以看出，在2 h 左右的迟缓期后开始进入对数生长期，在22 h时达到最大OD600nm值3.482±0.003；起始pH值为5.40 在2 h 后迅速下降，在22 h 时达到最低值4.16±0.021；从发酵液葡萄糖残留量的变化曲线可以看出，以每2 h接近1.0 g/l 的下降趋势下降，22 h时RG值最低，为7.58±0.144，与起始发酵液RG 值相比下降了8.25 g/l。

从乳酸片球菌的生长曲线图可以看出，在2 h 左右的迟缓期后开始进入对数生长期，在20 h时达到最大OD600nm值4.686±0.006；其pH 值从起始5.37 经过22 h下降到最低值4.21；与植物乳杆菌不同的是乳酸片球菌发酵液的RG 值要更低，24 h 时分别为7.58±0.144、4.42±0.144(P＜0.05)；与植物乳杆菌相比，乳酸片球菌的OD600nm值更高，24 h 分别为3.482±0.003、4.532±0.002(P＜0.05)。

与以上两种菌株不同的是，凝结芽孢杆菌在6 h左右才开始进入对数生长期，而且对数期较短，12 h左右其OD600nm值达到最大值4.361±0.011；其pH 值在14 h时开始达到最低值4.26±0.025，从12～24 h之间，其pH 值变化不大，接近平稳；其发酵液的RG 值在22 h 时最低7.00±0.250，介于植物乳杆菌与乳酸片球菌之间（P＜0.05）。

三种菌以OD600nm值1:1:1 接种的混合培养液，在2 h 左右进入对数生长期，2～8 h 之间OD600nm值变化较快，8～20 h 之间有段缓慢的增长期，20 h达到最大值3.741±0.003；同样其发酵液的pH 值变化也有两段变化，在22～24 h 时达到最低为4.24±0.006；其发酵液RG 值在24 h 时最低7.67±0.289，6～8 h 和14～18 h 两段时间，RG 值有两个明显变化(P＜0.05)。

2.2 菌种的活菌计数

表1 菌种发酵活菌测定结果(lg cfu/g)

由表1 可知同行数据，植物乳杆菌培养液在4～24 h 期间各时间点活菌数差异显著(P＜0.05)，说明4～16 h 处于对数生长期，16～24 h 处于衰退期；乳酸片球菌培养液4～16 h 处于对数生长期，各时间点活菌数差异显著(P＜0.05)，16～24 h 处于稳定期，各时间点活菌数差异不显著(P＞0.05)；凝结芽孢杆菌培养液在4～24 h 期间各时间点活菌数差异显著(P＜0.05)，4～10 h 处于对数生长期，10～24 h 处于衰退期；混合培养液在4～24 h 期间各时间点活菌数差异显著(P＜0.05)，说明4～16 h 处于对数生长期，16～24 h 处于衰退期。

由表1 同列数据可见，只有三组数据12 h 乳酸片球菌与混合培养液、16 h 乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌培养液无显著性差异外(P＞0.05)，同一时间其他不同菌种之间的培养液活菌数之间均是显著性差异(P＜0.05)。在三种菌及其混合培养24 h 过程中，植物乳杆菌、乳酸片球菌、凝结芽孢杆菌及其混合培养液分别在16、16、12、16 h 左右活菌数达到最大值。

2.3 指示菌黄曲霉孢子悬液浓度的确定

图2 为不同浓度的黄曲霉孢子悬液生长48 h 后的对比图，孢子悬液浓度为103孢子/ml 和104孢子/ml的平板，黄曲霉生长时间需5～7 d，实验周期过长。孢子悬液浓度为107孢子/ml 的平板，因孢子浓度过高，黄曲霉菌丝生长及孢子萌发过快，不易观察抑菌实验结果，在105孢子/ml 和106孢子/ml 中进行选择，从生长状况及易于观察方面考虑，故均以106孢子/ml浓度的菌悬液进行抑菌实验。

2.4 菌种发酵上清浓缩液的抑菌直径

图3 是三种菌及其混合培养的上清浓缩液的抑制黄曲霉效果图。从表2 可以看出，以浓度为106孢子/ml 黄曲霉为指示菌的六组数据，其中植物乳杆菌和乳酸片球菌的抑菌直径最大（P＜0.05）。

图2 不同浓度黄曲霉孢子生长对比（48 h）

表2 菌种发酵后上清浓缩液抑菌圈直径的测定结果

3 讨论

乳酸菌是人和动物肠道内主要的益生菌，当机体摄入乳酸菌等益生菌后，能在肠道内迅速成为优势菌群，抑制其他有害微生物的繁殖，增加乳酸含量，降低肠道pH值，并且提高饲料适口性[12]。

黄曲霉菌是发霉变质饲料中最常见的一种真菌，其代谢产物具有很强的致病性和致癌性。有研究表明，部分乳酸菌对黄曲霉菌的生长和产毒具有抑制作用，徐进等[13]在研究中发现植物乳杆菌可显著抑制黄曲霉生长与产毒。郑玮丽等[14]在研究中发现植物乳杆菌和副干酪乳杆菌对发酵乳产品坏包中的酵母菌、霉菌有不同程度抑制作用。而国内关于植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌及三种菌混合培养物对黄曲霉生长抑制鲜为报道。

Choi等[15]在研究中发现15 ℃条件下，泡菜发酵前期起主导作用的是柠檬明串珠菌，发酵后期清酒乳杆菌等乳杆菌开始发挥作用。张冬梅等[16]研究发现泡菜发酵前期肠膜明串珠菌占优势，发酵后期戊糖乳杆菌成为优势菌。本研究结合植物乳杆菌、乳酸片球菌、凝结芽孢杆菌单独培养及混合培养液的生长曲线、pH 值、RG 值、活菌计数及对黄曲霉的抑菌直径，混合培养液的OD600nm值、pH 值、RG 值及活菌数最大值在发酵过程中均介于三种菌之间，其24 h 发酵后上清浓缩液的抑菌直径介于三者之间，且混合培养的对数生长期明显变长，推测三种菌在混合培养过程中菌种生长可能会有先后顺序，其原因有待进一步研究。

Lavermicocca P[17-18]分离获得一株植物乳杆菌21B（L.plantarum 21B），将其发酵上清液浓缩10倍后进行抑菌实验，结果表明该菌能抑制黄曲霉FTDC3226 在内的十几种真菌的生长，与本实验结果一致。

4 结论

在抑菌试验中发现乳酸片球菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌及其混合培养的上清浓缩液均对黄曲霉的生长有抑制作用；乳酸片球菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌及其三者混合培养的上清浓缩液的抑菌直径分 别 为(15.860±0.050) mm、(15.737±0.155) mm、(14.287±0.096) mm和(15.173±0.032) mm；其中植物乳杆菌和乳酸片球菌的抑菌直径最大（P＜0.05）。