中蔗系列甘蔗品种的黑穗病抗性鉴定

张姗姗 ，张沛然 ，兰仙软 ，李茹 ，2，黄有总 ，陈保善 ，2

（1.广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004；3.广西大学农学院，南宁 530004）

0 引言

甘蔗是一种多年生的宿根性热带植物，是中国主要的糖料作物，甘蔗糖产量占全国食糖总产量的90%以上[1]。甘蔗黑穗病是一种世界性的甘蔗真菌病害，感染黑穗病的甘蔗植株叶细长，茎细小，一株染病所有分蘖都可能发病，严重影响甘蔗产量及品质[2-5]。目前，抗病育种是防治甘蔗黑穗病最经济有效的措施，世界各甘蔗种植国家都把黑穗病抗性作为选育新品种的指标之一[6]。

我国蔗区主要分布在广西、广东、云南、海南和福建，尤以广西种植面积最大。ROC22是广西蔗区长达20余年的主栽品种，种植面积达60%以上。ROC22对黑穗病敏感，其抗性等级被评定为高感[7-8]。由于甘蔗品种长期单一化，甘蔗黑穗病在广西蔗区越发严重[9]。因此，选育甘蔗抗黑穗病的新品种对广西甘蔗可持续发展具有重要意义。中蔗系列新品种中蔗1号、中蔗6号和中蔗9号田间综合表现优良，选育过程及多年多地试种表明，中蔗系列新品种田间表现出很高的黑穗病抗性。为全面评价这些品种的黑穗病抗性，本研究利用人工接种结合病区大田自然发病的方法，对其进行系统评价，以期为新品种审定、推广提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试品种

供试甘蔗品种：中蔗1号、中蔗6号、中蔗9号和ROC22。

中蔗系列品种（系）是由广西大学团队从ROC25×云蔗89-7组合选育的甘蔗新品种（系）。该系列甘蔗新品种与目前广西壮族自治区常规甘蔗种植品种相比较，具有大茎，有效茎多，特高产，高糖，宿根性好，高抗黑穗病，抗倒伏，极易脱叶，耐旱耐寒等优点[10]。ROC22为目前广西主栽品种，田间表现为高感黑穗病。

1.2 黑穗菌菌株的培养获得与接种

1.2.1 黑穗菌菌株的培养获得

2017年5月从广西河池、柳州、崇左3个蔗区采集黑穗病黑鞭，取少量冬孢子粉，用无菌水适度稀释后涂布至含有抗生素Amp+Kan+Cef+Sep的YEPS固体培养基，于28℃培养2～3 d，挑取单菌，获得单倍体担孢子分离株。将不同来源的担孢子分离株进行两两配对，于YEPS固体培养基上进行交叉培养（28℃，2～3 d），观察菌落生长情况。菌落若为白色羊毛状的，表明两单倍体为异型（+、-）交配型；菌落若为酵母状的，两单倍体为同型交配型。分别在每个来源地挑取一对配合最佳的异型交配型单倍体，保存于-80℃冰箱备用。JG35、JG36为实验室保存的从广西南宁市蔗区分离到的一对异型单倍体菌株。

1.2.2 接种方法

将保存于-80℃冰箱的异性交配型单倍体菌株在YEPS固体培养基划线活化，28℃恒温培养箱倒置培养2～3 d。挑取单菌落转接于YEPS液体培养基中，28℃摇床过夜培养。取1 mL培养液转接至20 mL新鲜的YEPS液体培养基中，培养至孢子浓度为1×107个/mL。4 000 r/min离心5 min收集菌体，沉淀用无菌水洗两次后，加入20 mL无菌水悬浮。将异型单倍体两两对应混合并充分摇匀，用于注射接种。

取半年蔗供试甘蔗茎，健康单芽种植于盆栽桶中（每桶种植5个芽）。每个处理设置5桶，共25个芽。当小苗生长至第5张叶片充分展开时，用无菌注射器将100 μL单倍体混合悬浮液（1×106个孢子）小心注入甘蔗生长点。以100 μL无菌水接种作为对照。

1.3 调查方法

1.3.1 人工接种调查

定期调查发病株数，统计不同品种发病潜伏期，计算每处理最终发病率。连续观察至发病终止。发病率=（累计发病株数/总株数）×100%。抗性等级划分采用农业部“九五”攻关项目病害的统一分级标准[11]（表1）。

表1 甘蔗黑穗病抗性等级评价标准Table 1 Evaluation criteria for sugarcane smut resistance

1.3.2 大田定点系统调查

按照全国甘蔗品种试验实施方案，对4个品种采用完全随机区组排列，3次重复，行距1．2 m，于2017年3月种植于广西崇左市扶绥县甘蔗试验地。试验地肥力中等，已种植甘蔗多年，为黑穗病重病区。一年宿根甘蔗黑穗发病率调查于2018年6月和10月进行。发病率以“丛”为单位计算，每个品种调查250丛。

1.3.3 生产示范点抽样调查

本实验室在广西龙州、武鸣、扶绥等县（区）有甘蔗生产示范点，由当地蔗农管理。龙州蔗区新植中蔗1号2．67 hm2，于2017年2月种植。武鸣华侨农场团结分场新植中蔗9号31．33 hm2，于2017年6—8月种植，2018年3月留宿根。广西大学扶绥农科基地有宿根2年中蔗1号0．27 hm2，中蔗9号0．13 hm2；新植中蔗1号13．33 hm2，于2018年8月初种植；新植中蔗6号20 hm2，于2018年8月初种植；新植中蔗 9号100 hm2，于2018年3—6月种植。以示范点周边农户大量种植的感黑穗病品种ROC22、桂糖42或柳城05-136为对照。对示范点及对照地块进行抽样调查，统计黑穗病发病情况。

2 结果与分析

2.1 人工接种鉴定结果

经单倍体分离与配合试验，本研究新挑选出3对交配型单倍体菌株，按分离地点和交配型属性分别命名为河1和河2、柳3和柳4及崇3和崇4，其中单数和双数分别属于不同的交配型。加上之前所分离的JG35和JG36菌株，共有4对菌株被用于接种试验。

人工接种发病率结果与抗性等级鉴定结果见表2。与广西主栽品种ROC22相比，3个中蔗系列品种对所有供试菌株组合的发病率更低且发病潜伏期更长，4个供试材料对黑穗病抗性强度依次为：中蔗9号＞中蔗1号＞中蔗6号＞ROC22（依据各品种4对接种菌株抗性等级平均值）。对同一品种而言，病原菌组合崇3+崇4导致的发病率最高，河1+河2组合导致的发病率最低，表明广西甘蔗黑穗病菌有致病性分化。无菌水注射均无发病。

表2 4个甘蔗品种人工接种黑穗病抗性鉴定结果Table 2 Smut resistance of 4 sugarcane varieties inoculated

2.2 大田宿根蔗抗病性表现

定点调查结果表明，拨节期（6月份）中蔗1号、中蔗6号的黑穗病发病率为0%，中蔗9号发病率为0.4%，ROC22的发病率为6.4%；工艺成熟前期（10月份）各品种的累计黑穗病发病率分别为0%、0%、0.4%和6.8%。此外，对中蔗1号和中蔗9号第二年宿根蔗进行全面调查，二者黑穗病发生率均为0%。

2.3 示范田及生产大田调查

2017年2月在广西龙州新植中蔗1号2.67 hm2，至2018年1月抽样调查，黑穗病发生率为0.2%；2017年6—8月在广西武鸣华侨农场团结分场新植中蔗9号31.33 hm2，系统观察至2018年3月，黑穗病发生率为0.1%；相同地块留宿根，系统观察至2018年10月，黑穗病发生率为0.05%。2018年3—6月在广西大学扶绥农科基地新植中蔗9号100 hm2，系统观察至2018年10月，黑穗病发生率为0%。同期在广西龙州的生产大田新植ROC22黑穗病发生率为4%～6%，宿根为12%～15%；桂糖42新植为6%～8%，宿根一年为14%～16%。广西武鸣新植ROC22黑穗病发生率为5%～6%，宿根一年为13%～14%；柳城05-136新植为3%～4%，宿根一年为10%～12%。广西扶绥新植ROC22黑穗病发生率为4%～5%，宿根一年为12%～14%；桂糖42新植为5%～6%，宿根两年为18%～22%。

3 讨论

甘蔗黑穗病是广西甘蔗病害中影响最严重的真菌性病害，该病害的发生是通过冬孢子传播实现的。黑鞭上成熟的冬孢子借气流、雨水、灌溉水和昆虫等方式进行传播，在适宜的温湿度条件下萌发[12]，侵染蔗芽。甘蔗黑穗病抗性鉴定的传统方法为浸渍接种法和针刺接种法[13]。但传统方法需要前期收集大量冬孢子，工作量大。本实验通过对少量冬孢子进行单倍体分离与配合，以异型交配型单倍体混合接种，发病潜伏期短，发病率高，可以充分鉴定出不同品种的抗性特性[14]。人工注射结果表明中蔗1号、中蔗6号、中蔗9号相对于ROC22对黑穗病表现出更高的抗性，这与田间调查的品种抗性趋势一致。值得一提的是，我们在大田中共调查了18个甘蔗品种或中间材料，除了从美国引进的材料GUC3和GUC8发病率为零外，其他13个甘蔗品种（1702、TD7、TD11等）黑穗病发病率都明显高于中蔗系列品种。感病品种宿根蔗比新植蔗发病严重，宿根年限越长，发病越为严重。而中蔗1号、中蔗6号、中蔗9号在田间表现出良好的抗性，且宿根蔗的黑穗病发生率没有增加的迹象。

甘蔗黑穗病菌主要通过蔗芽侵染甘蔗，双核菌丝体穿过芽鳞，盘踞于分生组织区，刺激组织病变，直至病鞭抽出[15]。甘蔗对黑穗病的抗性机制主要有形态学抗性和生理生化抗性两种机制。本研究中，人工注射接种发病率明显高于自然发病率，与前人研究结果一致[14，16]。人工注射接种直接跨越了蔗芽本身具有的形态学抗性机制，对甘蔗造成了创伤，并且直接把病菌带入了甘蔗植株体内，因此发病率较高。近20年来，ROC22一直是广西蔗区的主栽品种，随着时间的推移，ROC22黑穗病的发病情况也越来越严重。高抗黑穗病中蔗系列品种的应用推广，有望可以控制甘蔗黑穗病的蔓延。