鸡大肠杆菌的分离与鉴定

才兴蔓

（辽宁省葫芦岛市龙港区双树动物卫生监督所，辽宁葫芦岛 125101）

1 分离实验部分

1.1 材料

（1）病料来源

某肉种鸡场30周龄罗斯308种鸡10只。无菌条件下剖检取病鸡的心、肝、脾、肾等实质脏器3份，置冰箱4℃保存，备用。

（2）培养基

普通营养肉汤、普通营养琼脂平板、兔鲜血营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美琼脂平板、三糖铁琼脂斜面、半固体营养琼脂均按常规方法[9、10、11]自行配制。

（3）微量发酵管

糖微量发酵管由杭州天和微生物试剂有限公司提供。

（4）药敏试纸

药敏试纸由杭州天和微生物试剂有限公司提供。

（5）抗O因子血清

大肠杆菌标准O1、O2、O35、O78血清型均购自扬州大学农业部畜禽传染病学重点实验室。

（6）实验动物

小白鼠由辽宁医学院实验动物中心提供，每只体重约20g，31周龄罗斯308肉种鸡由大连庄河金泉种禽繁育有限公司提供，每只体重约3kg。

（7）主要仪器与设备

JP-A型架盘天平、自动立式电热蒸气压力消毒器（YX-350型）、DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱、打孔器恒温箱、净化台（超净工作台SW-CJ-IF型）、0.5号麦氏单位胶乳浊度比浊管新华一号定性滤纸、显微镜、染缸、可调式微量移液器、玻璃仪器。

1.2 方法

（1）病料的采集

在剖检病鸡时无菌取病鸡的心、肝、脾、肾等实质脏器3份，置冰箱4℃保存，备用。

（2）细菌的分离培养

①平板划线分离培养 细菌的分离培养方法有划线法和倾注法两种，本实验采用划线法。无菌条件下将病料分别接种于普通肉汤37℃培养24h后，接种于麦康凯琼脂平板，继续培养24h。

②细菌的纯化 观察麦康凯琼脂平板上分离培养的菌落，选纯红色典型菌落，标记后，接种营养肉汤进行纯培养，24h后接种普通营养琼脂斜面，进一步接种伊红美兰琼脂、SS琼脂、血液琼脂平板37℃培养24h。

（3）细菌的形态学观察

细菌标本片制作的基本步骤：触片→干燥→固定→染色→镜检。

（4）生化试验

取细菌纯培养物接种五种糖类微量发酵管（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管），置37℃培养48h后进行观察。并按常规方法接种三糖铁琼脂斜面和进行吲哚试验、M-R试验、V-P试验、半固体营养琼脂穿刺试验并观察试验结果。

（5）药物敏感试验

①菌液准备 钓取麦康凯琼脂培养基上单个菌落，接种于普通肉汤，37℃ 培养l0h，其浊度相当于0.5号麦氏标准，此时肉汤中活菌数为1X108CFU/mL。如肉汤中细菌浊度超过0.5号麦氏标准，用无菌生理盐水或营养肉汤稀释至0.5号麦氏标准相同的浊度。

②接种平板 用无菌棉签吸取调节好浓度的菌液，在营养琼脂平板表面涂抹接种，务必将细菌菌液涂布均匀。

③在琼脂平板上贴加抗菌药敏片 用灭菌尖头镊子夹取各种抗菌药药敏纸片，按一定密度分别贴到上述已涂布细菌的培养基表面，用镊子清压，确保药敏纸片与琼脂表面完全接触.纸片贴完15 min后将平板翻转过来，底部在上，置37℃ 恒温箱内培养l8h，取出观察，记录结果。

（6）分离血清型鉴定

挑取纯培养的菌落接种于液体（处理过的肉汤）培养基，37%培养12h后煮沸2h，经500Or/min，弃去上清，加入生理盐水作适度稀释。用一张清洁的玻板，取标准抗“O”单因的凝集现象。同时用生理盐水代替血清做对照组。

2 实验结果鉴定部分

2.1 细菌分离培养

在营养琼脂上37℃培养24～48h后，形成中等大小、圆形微凸起、表面光滑湿润、半透明灰白色菌落；在麦康凯琼脂上形成中等大小，表面光滑湿润的砖红色菌落；在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色带金属光泽的菌落；在SS琼脂上生长较差呈红色；在血液琼脂上出现菌落较大，有粘性边缘整齐、并有隆起的灰白色菌落，呈完全溶血；分离菌在肉汤中培养18～24 h，呈均匀混浊，管底有淡白色粘稠沉淀，部分菌株可在肉汤表面形成菌环。

2.2 细菌形态学观察

病鸡心、肝肾等组织培养物涂片、染色、镜检，均可见两端钝圆，多数散在排列，偶尔有2～3个连在一起的革兰氏阴性短杆菌。

2.3 生物化学试验

生化试验结果显示，细菌在三糖铁培养基上生长表面产酸，底部产酸产气，不产生H2S，初步鉴定是大肠杆菌。从表1可以看出，此次分离的大肠杆菌对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖酵解产酸产气，M-R和靛基质试验、运动性试验结果阳性，V-P、枸橼酸盐利用试验呈阴性，符合大肠杆菌的生化特性[8]。

2.4 药敏试验结果

药敏实验结果根据抑菌圈的大小可见：该菌对阿米卡星、恩诺沙星极度敏感；对卡那霉素、庆大霉素、氟苯尼考高度敏感；对环丙沙星、沙拉沙星、阿莫西林中度敏感；对诺氟沙星、土霉素低度敏感；对头孢唑啉钠、新霉素、红霉素、新诺明、氨苄西林不敏感。

2.5 分离菌的血清型鉴定

根据玻版的凝集情况显示：本次实验分离到的致病性大肠杆菌菌株主要为O78型。