天然免疫介导凋亡-炎症途径参与骨关节炎发病的研究进展

周炎，刘世清

(武汉大学人民医院骨科，湖北 武汉 430060)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是多种因素作用于滑膜、关节囊、软骨及软骨下骨，以慢性滑膜炎、关节软骨退变及软骨下骨重塑为特点的退行性骨关节疾病[1]。流行病学调查显示，美国50岁以上人群中因OA引起的重度疼痛及功能受限约占23%。基于六大行政区划的中国40岁以上人群原发性OA总体患病率为46.3%[2]。随着社会老龄化进程及肥胖的日益加重，OA发病率逐年增加，导致患者身体残疾及生活质量降低，给患者带来沉重的经济负担，OA已经演变成为严重的社会问题，值得广泛关注。

长期以来，许多学者致力于关节软骨生理、病理及软骨细胞代谢等方面的基础研究，并在OA病因及病理机制方面达成了一定共识。目前普遍认为OA与遗传因素、年龄、体重及外伤等因素有关，其病理改变主要涉及关节软骨细胞外基质降解、软骨细胞凋亡及软骨成分自身免疫反应等[3]，软骨细胞凋亡及炎症机制在OA中扮演着重要的角色。近年来，随着研究的逐渐深入，OA在分子生物学方面的发病机制越来越引起学者们的关注，由机体天然免疫系统介导的慢性、低度炎症反应在OA发病机制中的作用逐渐成为研究热点[4]，开辟了OA研究的新领域，将使我们更加全面地认识OA，为OA早期防治提供新思路。

1 天然免疫系统与OA密切相关

过去十余年，对OA发病机理的认识经历了渐进而根本的转变，OA不再仅仅被认为是由于自身正常磨损所致典型的退行性疾病，而是由多种危险因素共同参与及相互作用引起，其中低度及慢性炎症反应起着至关重要的作用，尤其在OA早期阶段表现更为突出。近年研究提出，OA所表现的低度及慢性炎症反应是由机体天然免疫系统激发，同时伴有关节局部组织损伤及代谢功能紊乱[5]。

不同于获得性免疫系统，天然免疫系统是机体天然免疫细胞和分子在识别病原体及其产物或体内损伤、衰老、突变细胞等抗原性异物后，发生活化并有效吞噬杀伤病原体或体内"非己"抗原性异物，产生非特异性免疫保护作用的过程[6]。而对于OA表现的炎症及其他病理学改变，天然免疫系统作为机体抵御的第一道防线是如何发挥作用呢？Scanzello等[7]研究表明由创伤、劳损及退变等因素引起的软骨细胞及细胞外基质的损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，可激活机体天然免疫系统，从而调节关节炎症反应及促进损伤组织的修复。在OA形成过程中，DAMPs作为内源性分子可传导信号至天然免疫细胞，通过与细胞膜上多种模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)相互作用，引起关节无菌性炎症反应，并触发机体的保护作用[8]，其中，Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)为最主要的PRRs。通过激活蛋白-1、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白、干扰素调节因子及核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的作用，被激活的TLRs可导致促炎细胞因子释放，并证实与滑膜炎、软骨退变及OA易感性密切相关[7]。研究表明，人体软骨细胞中可检测到TLRs表达，在OA患者关节软骨及滑膜组织中TLR2及TLR4表达量明显升高，且经TLRs激动剂刺激后，软骨细胞中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases，MMPs)、一氧化氮(nitric oxide，NO)及前列腺素E2表达明显升高，并激活巨噬细胞的活性，导致软骨退变加速[9]。

补体系统是先天免疫的另一个重要组成部分，由30多种血浆和膜结合蛋白组成，可通过经典途径、替代途径和凝集素途径激活，但都会聚到C5b到C9形成的补体膜攻击复合体中。补体系统的主要生物学功能是识别“异物”颗粒和大分子，并通过调理或裂解促进其消除[10]。在OA患者滑膜及滑液组织成分中，均可检测到补体成分的沉积，OA软骨细胞通过上调IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子，亦可合成补体成分[11]。由于软骨重塑和修复失调而导致软骨细胞外基质的释放，以及软骨细胞凋亡改变等OA特征性病理改变，可能是通过激活补体系统来完成，软骨细胞产生的补体可以与滑膜来源的补体协同作用，可显著增强OA的病理性反应[12]。研究表明，在内侧半月板切除小鼠模型中，敲除补体途径(C5和C6)组分，可减轻OA关节软骨损伤，而敲除CD59保护素可促进野生型小鼠的关节软骨退行性改变[12]。通过阻断补体激活的策略已成为OA治疗的潜在靶标，但是否需要补体慢性抑制以及这种抑制可能产生的不良影响尚未清楚，有待进一步探讨。

作为天然免疫细胞的重要成员，被DAMPs及补体活化的巨噬细胞及肥大细胞与OA发病密切相关。OA关节滑膜组织中被激活的巨噬细胞通过产生白细胞介素-1β(interleukin，IL-1β)、淋巴毒素-α及MMPs等细胞因子，广泛参与OA软骨组织破坏及骨赘形成[13]。OA滑膜组织中也存在被激活的肥大细胞，肥大细胞数量越多，滑膜炎症和结构损伤程度越高[14]。此外，OA滑膜组织肥大细胞的类胰蛋白酶活性高于正常滑膜组织，肥大细胞类胰蛋白酶释放到关节滑液中，刺激纤维母细胞的增殖和促炎细胞因子的释放，导致OA发病[15]。另一种典型的肥大细胞介质是组胺，与类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)相比，OA滑膜组织肥大细胞的组胺含量接近或更高，但组胺释放量较低[16]，肥大细胞及其介导因子在OA发病中的确切作用尚不清楚。

脂肪细胞可产生许多脂肪因子，包括瘦素、抵抗素、脂联素和减脂素，它们作为OA的生物标志物，在某些情况下，可能通过上调MMPs和蛋白聚糖酶介导关节软骨破坏[17]。在OA患者关节滑液中瘦素的浓度高于血清中的浓度，与严重OA患者的体重指数(body mass index，BMI)显著相关，与相同年龄和BMI的男性相比，女性关节腔内具有更高的瘦素浓度，这些结果高度提示关节内瘦素水平可能有助于增加女性OA发病率，瘦素介导的信号通路对于调节代谢引发的炎症反应至关重要[18]。脂联素作为一种脂肪细胞因子具有维持能量代谢内稳态、调节免疫平衡、调控细胞增殖的作用，为先天免疫系统与新陈代谢之间建立了额外联系，与OA发病呈负相关性[19]。

天然免疫系统被DAMP-PRR信号途径激活后，产生一系列炎性介质，启动正常的免疫应答，从而开启关节软骨组织自我修复之旅，同时DAMP-PRR信号长期异常活化引发的炎症反应，可加重软骨组织的损伤。天然免疫系统在OA发生发展中具有双向调节作用，可能成为OA发病机制中重要的组成部分，值得深入研究及探讨。

2 天然免疫重要分子-表面活性蛋白D(surfactant protein D，SP-D)在OA中的异常表达及功能

生物体在长期种系发生及进化过程中逐渐形成的天然免疫体系，主要由屏障结构、天然免疫细胞、天然免疫分子组成。SP-D是起初在肺组织中发现的一种重要天然免疫分子，主要由Ⅱ型肺泡细胞和呼吸性细支气管上Clara细胞分泌并储存于板层小体，属于凝集素蛋白家族成员，为亲水性蛋白，在维持肺免疫功能、参与宿主防御、清除机体凋亡细胞及调节炎症反应等方面发挥着重要作用[20]。SP-D是一种胶原凝集素，分子量约为43 000 Da，其一级结构由钙离子依赖的碳水化合物识别区域(carbohydrate recognition domain，CRD)、氨基酸末端区、颈区及胶原样区四部分组成，三级结构为3个单位的胶原样区以并联形式相连的三聚体，四级结构由4个三聚体以二硫键形式交联形成十字形结构[21]。近年来，在肺外如肾脏、肠系膜上皮、胰腺、胆囊、鼻黏膜、前列腺及生殖系统中，纷纷检测到SP-D表达。体外研究证实SP-D具有参与介导调节多种免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和树突细胞等功能[22]。近期Zhou等[23]研究发现，人及大鼠软骨组织中检测到SP-D表达，且正常软骨组织中的表达量高于OA软骨组织。

研究发现，在RA患者关节滑液中SP-D表达升高，其来源主要由滑膜深层的血管内皮细胞产生[25]；血清SP-D在RA患者不同阶段及健康个体中呈现昼夜变化趋势；SP-D基因编码的多态性与RA侵袭性及患者吸烟史密切相关，在有吸烟史的侵袭性RA中，血清SP-D表达显著降低；表明SP-D在体现RA发病机制方面，可能在激发机体天然免疫系统及调节关节炎症反应等方面扮演着重要的角色[26]。SP-D可抑制硝普钠(Sodium nitroprusside，SNP)诱导的软骨细胞凋亡，在体内发挥对大鼠关节软骨组织的保护作用[23]。通过敲除SP-D基因或过表达，观察小鼠体内凋亡细胞清除速率，发现SP-D过表达小鼠体内的清除速率明显高于SP-D敲除小鼠，提示SP-D具有清除凋亡细胞的功能[27]。通过盲肠结扎穿孔术后脓毒症诱导急性胰腺炎及肾损伤时，SP-D基因敲除小鼠中胰腺细胞及肾小管上皮细胞凋亡率及血清促炎细胞因子明显高于野生型小鼠[28-29]。SP-D可降低由肺炎诱导的脓毒症小鼠小肠上皮细胞凋亡，减少促炎细胞因子释放，达到保护肠道屏障的功能[30]，由胆囊产生的SP-D可释放到肠道内，与肠道共生的菌群选择性结合，维持肠道免疫内稳态[31]。SP-D可调节小鼠睾丸免疫环境，通过抑制睾丸免疫炎性反应，让精子更好获能，提升精子的生殖功能[32]。在内毒素诱导的大鼠脑室周围白质软化实验研究中，SP-D通过降低少突胶质细胞凋亡及低髓鞘化，达到脑神经功能保护作用[33]。SP-D可特异性结合TLR4胞外受体结构域，从而抑制TLR4表达及炎症因子释放，维持表面活性物质稳态，介导先天性防御、清除凋亡细胞及调节炎症反应[34]。

软骨细胞凋亡是OA关节软骨的特征性病理学改变，主要表现为软骨细胞皱缩、核染色体固缩、DNA碎裂、质膜囊泡及凋亡小体形成，并伴有软骨基质钙化及降解。软骨细胞凋亡发生率与软骨基质损耗及破坏程度具有高度一致性，确立了软骨细胞凋亡机制在OA发生发展过程中的重要地位。另一方面，多种促炎因子如IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等已被证实在OA发病进程中起关键性作用，可导致软骨细胞合成与分解代谢失平衡，使软骨细胞成分、结构及功能发生改变，共同促进OA炎症的发生、发展，现如今OA已被确认为是一种炎性疾病[35]。研究证实SP-D与OA发生发展存在重要的相关性，SP-D通过抑制软骨细胞凋亡[23]，并可能通过降低促炎性细胞因子释放，在OA发病过程中扮演着抗凋亡及抗炎角色，起到保护关节软骨的作用。

3 SP-D参与调节OA软骨细胞凋亡-炎症的可能机制

TLR信号级联包含许多蛋白质，如骨髓分化初级反应蛋白88(myeloid differentiation primaryresponse gene 88，MyD88)及NF-κB，它们的活性均由S-亚硝基化来调节[36]。SP-D中具有高亲和力的CRD识别区域与一种可溶性形式复合体TLR4和髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2，MD-2)相互作用，可抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)与TLR4/MD-2胞膜受体结合，阻止TLR4二聚化，从而下调TNF-α表达及抑制NF-κB通路活化[37]。SP-D的寡聚结构是其关键的功能基团，其CRD识别区域与炎症抑制受体-信号调节蛋白-1α(signal regulatory protein-1α，SIRP-1α)进行相互作用，通过激活蛋白酪氨酸磷酸酶-1(tyrosine-protein phosphatase-1，SHP-1)来抑制NF-κB通路活化，是SP-D另一种调节机制[38]。

NF-κB是一种能特异性结合相关基因启动子或增强子的真核细胞转录因子，广泛参与调控细胞增殖、分化、周期、凋亡及炎性反应等过程，是Rel基因家族重要成员。NF-κB家族包括Rel(c-Rel)、RelA(p65)、p50、p52及RelB五种亚基。在静息状态下，无活性NF-κB以潜在状态分布于胞浆中，并与抑制因子结合成为异源多聚体P50-P60-IκBα(IκBβ)。在多种因素的刺激下，IκBα从三聚体中游离出来，p50亚基上的易位信号及p56亚基上DNA结合位点被充分暴露，使异二聚物显示出NF-κB活性，并易位入细胞核，结合到启动子/增强子区域，激活靶基因，发挥其调控作用[39]。研究证实，激活NF-κB信号通路可促进IL-6、TNF-α、MMPs等多种炎性及降解因子的转录，调控Caspase-3、Bcl-2及Bax表达，广泛参与调节软骨细胞炎症及凋亡过程，引起软骨基质降解，在OA发病机制中具有重要作用[40]。在OA发生发展过程中，SP-D异常表达对OA软骨细胞凋亡及炎症的影响，可能存在凋亡-炎症信号TLR4/MyD88/NF-κB通路介导SP-D抑制OA软骨细胞凋亡及炎症的关键分子事件，有待深入探讨。

综上所述，从天然免疫系统及天然免疫分子SP-D介导OA发病及调节软骨细胞凋亡及炎症角度，阐明OA发生发展的分子机制，有利于深化天然免疫系统与OA发病机制的关系，有望成为揭示OA发生发展的一种新机制，为建立可能的干预手段寻找到新的靶点。