卵巢癌组织中lncRNA-PVT1、miR-31的表达变化及其临床意义

刘晶晶，陆娟，张彬彬，李丹

(本溪市中心医院，辽宁本溪117000)

卵巢癌是临床上较为常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，其发病率在所有女性生殖系统恶性肿瘤中位居第3位，其中上皮性卵巢癌在卵巢癌中是最常见的病理类型。由于卵巢癌在发病早期具有较强的隐匿性，且易出现多脏器的癌细胞增殖、淋巴结转移等，患者5年生存率仅为30%左右，病死率在所有妇科恶性肿瘤中位居首位[1]。研究[2]发现，长链非编码RNA(lncRNA)介导机体多种复杂生物学过程，在染色质调控、重塑以及组蛋白修饰、基因组印迹等方面发挥着至关重要的作用。研究[3]显示，长链非编码RNA浆细胞瘤移位基因1(lncRNA-PVT1)位于染色体8q24.21上，在鼻咽癌、前列腺癌以及乳腺癌等多种肿瘤中表达升高,其可在转录水平、转录后水平及蛋白质水平影响下游癌基因的表达，促进肿瘤细胞的增殖、浸润和转移等行为。微小RNA(miR)是细胞内小的非编码RNA分子，长度约为18～25个核苷酸，可结合靶基因mRNA的3′端非翻译区，降低mRNA的稳定性，调控基因表达，影响细胞的发育、分化、增殖和凋亡等生物学行为。研究[4]发现，miR-31在乳腺癌、胃癌等多种肿瘤中呈明显低表达，miR-31通过结合并抑制Ras同源基因家族成员A(RhoA)等基因的mRNA的表达，抑制下游信号传导通路的传导，发挥抑制增殖、浸润、转移的作用。有研究[5，6]表明，lncRNA-PVT1能够作为分子海绵结合并抑制miR-31的表达，导致miR-31失去对下游周期素依赖性激酶1(CDK1)的表达抑制作用，促进肿瘤细胞的恶性增殖。本研究观察了卵巢癌组织中lncRNA-PVT1、miR-31的表达情况，分析两者间的相关性及与卵巢癌患者临床病理参数的关系，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年2月～2017年2月本溪市中心医院收治的卵巢癌患者93例，年龄41～77岁，平均年龄(58.23±10.73)岁，其中FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期61例、Ⅲ～Ⅳ期32例，高分化26例、中分化34例、低分化33例，腹膜转移59例、淋巴结转移44例，组织学类型为浆液性53例、非浆液性40例，肿瘤直径<2 cm者31例、肿瘤直径≥2 cm者62例。患者均接受手术治疗，术中留取癌组织及癌旁组织，迅速置于冻存管内，液氮速冻后，置于-80 ℃冰箱保存。纳入标准：①研究对象均经手术病理组织活检确诊为卵巢癌,均符合2009年国际妇产科联盟(FIGO)诊断标准[6]；②既往无放化疗及免疫治疗病史；③无临床病历资料缺失。排除标准：①合并其他恶性肿瘤疾病者；②伴有心、肝、肾等重要脏器功能障碍者；③交流沟通障碍或伴有精神疾病者。本研究获得研究对象同意，并得到医院伦理委员会批准。

1.2 卵巢癌组织及癌旁组织中lncRNA-PVT1、miR-31检测方法 取50 mg组织标本，采用TRIzol法提取癌组织及癌旁组织总RNA。取1 μg总RNA，采用TaKaRa反转录试剂盒合成cDNA，并采用SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增。引物序列如下：lncRNA-PVT1上游引物为5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，下游引物为5′-AGAGCACCAAGACTCGCTCT-3′；GAPDH的上游引物为5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，下游引物为5′-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3′；miR-31上游引物为5′-GTTGGAGACGACGCAAGAT-3′，下游引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。实时荧光定量PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，循环37次。将GAPDH作为lncRNA-PVT1的内参，以U6作为miR-31的内参，以2-ΔCt表示目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 卵巢癌组织与癌旁组织中lncRNA-PVT1、miR-31表达比较 卵巢癌组织中lncRNA-PVT1、miR-31的相对表达量分别为3.10±0.24、0.53±0.12，癌旁组织中lncRNA-PVT1、miR-31的相对表达量分别为1.02±0.17、0.94±0.14，两者相比，P均<0.05。

2.2 卵巢癌组织中lncRNA-PVT1、miR-31表达的相关性 卵巢癌组织中lncRNA-PVT1、miR-31表达呈负相关关系(r=-0.672，P=0.012)。

2.3 癌组织中lncRNA-PVT1、miR-31表达与卵巢癌患者临床病理参数的关系 癌组织中lncRNA-PVT1、miR-31表达与卵巢癌患者临床病理参数的关系见表1。表1显示，lncRNA-PVT1、miR-31表达与卵巢癌患者肿瘤FIGO分期、腹膜转移及淋巴结转移有关(P均<0.05)。

3 讨论

卵巢癌是女性较为常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性的生命。由于该病早期缺乏明显的临床表现，因此约70%的卵巢癌患者一经确诊便已是中晚期或发生远处转移，丧失手术根治的最佳时机，预后较差[7]。因此，寻找卵巢癌发生发展相关的关键驱动因子并确定其作用机制，对卵巢癌的临床诊断和治疗具有重要的价值。非编码RNA(ncRNA)是近年发现的调控基因表达的重要分子，包括lncRNA、miRNA及环状RNA等，能够在转录、转录后、翻译及蛋白水平调控靶基因的功能，参与细胞发育、分化等过程[8],在肿瘤、自身免疫性疾病及神经退行性疾病中均发挥重要的调控作用，有望成为疾病诊断、治疗的重要靶点[9]。

表1 癌组织中lncRNA-PVT1、miR-31表达量与卵巢癌患者临床病理参数的关系

lncRNA属于近年来所发现的一类长度≥200核苷酸的新型RNA分子，其不具有编码蛋白质的功能，但广泛参与了机体的基因表达调控、蛋白复合体启动、亚细胞结构构建以及肿瘤细胞侵袭转移等多种复杂的生物学行为过程[10]。研究[11]显示，lncRNA-PVT1在多种肿瘤中表达增高，可通过参与DNA重排、编码miRNA以及与MYC蛋白相互作用参与细胞表达调控，促进肿瘤细胞的增殖、浸润及远处转移。本研究结果显示，卵巢癌组织中lncRNA-PVT1表达明显高于癌旁组织，其机制可能是肿瘤发生时原癌基因MYC表达增加，而MYC蛋白能够结合PVT1基因启动子区域的E盒区，促进PVT1基因的表达[12]。此外，本研究结果显示，卵巢癌患者lncRNA-PVT1表达还与FIGO分期、腹膜转移及淋巴结转移密切相关，其机制可能是lncRNA-PVT1通过影响癌基因及抑癌基因重排，发挥促进肿瘤增殖作用。研究[13]发现，lncRNA-PVT1能够促进含WW结构域的氧化还原酶(WWOX)等抑癌基因的基因重排，导致WWOX基因失活，促进肿瘤细胞的增殖，导致分期增高。研究[14]显示，lncRNA-PVT1可直接结合并抑制miR-200a和miR-200b，而miR-200a和miR-200b抑制MMP9表达，lncRNA-PVT1以转录后调控的方式上调MMP9表达，促进肿瘤的浸润和转移的发生，导致肿瘤发生腹膜转移和淋巴结转移。

miRNA是一类广泛表达于真核生物内的小分子单链非编码RNA，成熟的miRNA参与构成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，通过碱基配对的方式结合靶基因mRNA的3′端非翻译区，改变mRNA的稳定性，调控基因表达[15]。miR-31作为miRNA的一员，能够抑制磷脂酰肌醇3激酶/丝苏氨酸激酶1(PI3K/AKT)信号通路中PI3K等多种关键癌基因表达，发挥抑癌基因的作用。多项研究[16]证实，miR-31在肝癌、肺癌等多种肿瘤中均存在表达下降的现象，miR-31表达降低导致配对盒基因9(PAX9)表达增加，最终促进肿瘤细胞的增殖、浸润和转移等生物学过程。本研究中，miR-31在卵巢癌组织中的表达水平明显较癌旁正常组织低，其表达降低的机制可能与miR-31基因启动子区表观遗传学修饰后导致基因表达沉默有关。有研究[17]报道，肿瘤细胞中miR-31基因启动子区的甲基化导致miR-31表达降低，进而导致下游转录因子1(E2F1)表达增高，促进肿瘤细胞增殖。此外，本研究结果显示，miR-31表达与卵巢癌患者的FIGO分期以及腹膜转移、淋巴结转移存在密切相关，可能是因为肿瘤细胞中miR-31可通过直接抑制大肿瘤抑制基因2(LATS2)的表达，促进调控上皮间质转化过程中的关键转录因子的表达，导致肿瘤细胞向间质性表型转化，促进肿瘤的增殖及转移。

有研究[6]报道，肿瘤细胞中的lncRNA-PVT1能够作为分子海绵结合并抑制miR-31的表达，从而发挥对miR-31下游增殖、转移相关癌基因的表达调控作用。本研究进行相关性分析可得，卵巢癌组织中lncRNA-PVT1表达与miR-31表达呈明显负相关关系，与相关研究结果一致，但目前两者相互作用的机制尚不清楚。

综上所述，卵巢癌组织中lncRNA-PVT1高表达，而miR-31低表达，两者负相关，两者表达与卵巢癌患者肿瘤FIGO分期、腹膜转移及淋巴结转移有关，有可能成为新的卵巢癌诊断标志物，可用于辅助判断卵巢癌的进展情况，但两者在卵巢癌发生发展过程中的作用机制有待深入研究。