大豆胰蛋白酶抑制因子的危害及其检测研究进展

■王 耀 吴佳蓓 王珍玉 李燕虹， 邓瑞广 胡骁飞*

（1.河南科技大学 食品与生物工程学院 食品加工与安全国家级实验教学示范中心食品原料河南省工程技术研究中心，河南洛阳471023；2.河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室，河南郑州450002）

大豆含有丰富的蛋白质、均衡的必须氨基酸和营养元素，属于植物蛋白中为数不多的优质蛋白资源，然而大豆中也含有多种抗营养因子，包括胰蛋白酶抑制因子、凝集素、抗原蛋白、异黄酮、单宁、和生物碱等[1]，它们对动物消化、吸收营养物质造成不良影响，限制了大豆在食品工业及饲料工业中的利用效率。胰蛋白酶抑制因子在抗营养因子中含量较高，是主要的一类抗营养因子，因此它在饲料原料中的含量是评价大豆饲料原料质量优劣的重要指标。介于大豆在现实生活中在食品及饲料工业中的广泛应用，研究大豆胰蛋白酶抑制因子的性质、危害机理及其检测方法就显得尤为必要。本文对大豆胰蛋白酶抑制因子的危害及其检测方法研究进行综述，以期为食品工业及饲料工业中大豆胰蛋白酶抑制因子的高效监测提供依据，为大豆胰蛋白酶抑制因子检测方法的深入研究与应用提供一定的参考。

1 大豆胰蛋白酶抑制因子概述

大豆胰蛋白酶抑制因子（Soybean trypisin inhibitor，STI）主要可以分为Kunitz型、Bowman-Birk型、Kazal 型、PotatoⅠ型及PotatoⅡ型等，含量相对较高的是Kunitz 型胰蛋白酶抑制因子（Kunitz trypisin inhibitor，KTI）和Bowman-Birk 型胰蛋白酶抑制因子（Bowman-Birk inhibitor，BBI）[2]，在大豆中的含量分别约为1.4%和0.6%[3]。KTI 由Kunitz 首次从大豆中分离并结晶而命名，相对分子质量为20 000～25 000，该抑制因子具有一个活性中心，可结合一分子的胰蛋白酶[4]。BBI由Bowman首先从大豆中分离并由Birk鉴定而得名[5]，相对分子量为6 000～10 000，该抑制因子有两个活性中心，可分别与胰蛋白酶和糜蛋白酶结合，故又被称为双头抑制因子[6]。

大豆胰蛋白酶抑制因子的抗营养机理主要体现在一方面能结合动物消化系统中的胰蛋白酶，生成有机复合物，导致胰蛋白酶不能作用于蛋白质，使蛋白质不能很好的被分解消化；另一方面它引起机体内蛋白质内源性消耗，最终会致使胰腺及其他组织器官的增生和肥大[7]。

2 大豆胰蛋白酶抑制因子的危害

2.1 对蛋白质消化率和利用率的影响

大豆胰蛋白酶抑制因子会与小肠液中的胰蛋白酶、糜蛋白酶结合，生成无活性的复合物，使酶的活性丧失，导致蛋白质消化利用率下降，同时引起动物体内蛋白质的内源性消耗[8]。王桂芹等[9]研究发现，将鱼食中的抗胰蛋白酶抑制因子除去后，鲤鱼体重、蛋白酶活力、RNA/DNA 和血清IGF-I 显著高于对照组，说明大豆抗胰蛋白酶抑制因子会导致鱼类的蛋白酶活性下降，使蛋白质和其他营养物质的利用率下降。张建云等[10]通过喂食幼兔不同日粮一定时间后，观察记录幼兔对蛋白质和其他营养物质的吸收利用情况，当幼兔食用的饲料中含有大豆成分时，氮的平衡和养分消化率会受到影响，而喂食幼兔的饲料中不含大豆成分时，饲料利用率不会受到影响。

2.2 对胰腺组织的影响

胰腺是重要的消化器官，能够保证机体对于营养物质的消化吸收，同时也担负着调节消化系统中各生理过程的功能。Huisman 等[11]研究发现长期喂食大鼠生大豆，其胰腺分泌能力增强，可引起胰腺细胞肿大，细胞质会含有较多的酶原颗粒。韩玲玲[12]系统研究了大豆胰蛋白酶抑制因子对胰腺的损伤，研究发现胰蛋白酶抑制因子能够增加自由基，导致氧化应激的产生，使胰腺氧化损伤，进而产生胰腺肿大，影响胰腺分泌功能。李淑君[13]以胰腺线粒体为研究对象，发现大豆胰蛋白酶抑制因子能够诱导线粒体氧化应激，使线粒体出现肿胀空泡化及细胞核溶解等不可逆损伤。

2.3 对动物生长的影响

胰蛋白酶与抑制因子的亲和力比与胰蛋白酶底物的亲和力高，结合速度也更快，且结合形成的复合物具有紧密连接的化学键，该化学键不容易被破坏，同时也意味着不容易被机体消化吸收，所以只能通过粪便的形式排出体外，由此造成了大量氨基酸的流失，最终导致出现生长缓慢的现象[14-15]。大豆胰蛋白酶抑制因子对动物生长有显著影响，但是根据动物的种类不同，影响程度的大小和胰蛋白酶抑制因子引起异常变化的部位也不尽相同。Herkelm 等[16]研究表明，胰蛋白酶抑制因子对仔猪生长具有明显的抑制效果，在不同生长阶段的动物，对大豆胰蛋白酶抑制因子的反应强度会因年龄、种类和体重等因素的影响而不同。此外，有试验表明大豆胰蛋白酶抑制因子对机体生长抑制的效果强弱与其在日粮中的含量相关，随着含量不断增加，仔猪生长速度也会随之下降[17]。

3 大豆胰蛋白酶抑制因子的检测方法

近年来，针对大豆胰蛋白酶抑制因子的检测方法研究逐渐展开，已成为相关学者们的研究热点方向。目前，对于大豆胰蛋白酶抑制因子较为成熟的检测方法包括脲酶检测法、酶化学检测法和免疫检测法。

3.1 脲酶检测法

大豆中胰蛋白酶抑制因子与脲酶有相似的含量和活性，当大豆胰蛋白酶抑制因子进行相关处理时，脲酶的活性也会随之受到相应的损害，其变性失活的程度与胰蛋白酶抑制因子相似，由于大豆制品中的脲酶含量较易检出，故可通过脲酶的检测间接检测胰蛋白酶抑制因子[18]。目前脲酶的测定方法主要有pH 值增值法和滴定法。pH 增值法是利用脲酶将尿素水解产生氨气，从而引起反应体系pH 值变化，来计算脲酶的活性[19]。滴定法是利用过量的盐酸中和尿素被脲酶分解产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴[20]。但因为脲酶易于分解，通过不同的温度处理方法可以部分或者全部使其钝化失活，当大豆及其相关产品受热程度过高时该方法就不再适用。此外，脲酶的活性还受水分、压力的影响，所以该方法的适用性较差。

3.2 酶化学检测法

Kakade 等[21]最早提出酶化学法来测定大豆制品中的大豆胰蛋白酶抑制因子，是一种比较经典的方法。该方法的原理是以有色的苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰基苯胺（DL-BAPA）作为胰蛋白酶底物，在标准酶溶液中加入不同量抑制因子，测定活性减少的程度，然后绘制出抑制曲线，即可通过比色并根据曲线得到待测样品所含抑制因子的量。但该方法对于大豆胰蛋白酶抑制因子的检测灵敏度相对较低，对于加热过度样品的检测结果变异较大，而且样品提取液中除胰蛋白酶抑制因子之外的其他成分，如植酸、单宁、脂肪酸等物质，均会对胰蛋白酶活性产生抑制，所以会对真实结果产生影响[22]。

3.3 免疫检测法

酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一种经典的免疫检测方法，在大豆抗营养因子检测中应用较为广泛[23-24]。该方法是在抗原抗体特异性结合的基础上，利用酶的高效催化特性，将试验反应结果放大，从而使结果更容易被定性和定量，该方法拥有酶催化反应的敏感性以及抗原抗体反应的特异性，因此具有较高的灵敏度[25]。张国龙等[26]利用兔源多克隆抗体建立了3 种检测KTI 的ELISA 方法（酶标抗原直接竞争、酶标抗体直接竞争、间接抑制法），3种方法的检测限均能够达到20 ng/ml，可用于大豆和大豆产品中KTI 的定量检测。邢春芳等[27]同样利用大豆胰蛋白酶抑制因子多克隆抗体，建立了间接竞争ELISA 方法，能够代替酶化学检测法用于豆粕及豆制品中胰蛋白酶抑制因子的检测。Xu 等[28]通过制备KTI 单克隆抗体，建立了KTI 的夹心ELISA 检测方法，该方法具有较高的灵敏度，最低检测限为0.148 1 ng/ml。ELISA 方法具有成本低廉、简便快速、敏感特异且不需大型仪器设备等优点，对于样品纯度要求不高，非常适合批量样品的快速筛查[29]。

免疫层析试纸检测方法是在ELISA 方法基础之上发展起来的一种免疫检测方法，该方法在抗原抗体特异性反应的基础上，利用与抗体偶联的有色或发光纳米材料的光学特性，可通过裸眼或借助简单仪器对检测结果进行直观判定，相对于ELISA方法更为快速，但其通常用于定性与半定量检测，该方法目前已在大豆抗营养因子检测方面得到了应用[30-31]。Xu等[28]同样利用单克隆抗体，通过夹心模式建立了KTI免疫层析试纸检测方法，试验表明该方法检测牛奶样品中KTI的检测限为5 ng/ml，并且能够用于大豆样品中KTI的半定量分析。

4 小结与展望

大豆胰蛋白酶抑制因子严重影响了大豆在食品工业及饲料工业中的利用率，其检测研究已成为食品及饲料安全监控的重要技术支撑。酶化学检测法虽然是检测大豆胰蛋白酶抑制因子的经典方法，但其灵敏度低、测定结果不稳定，且检测结果不能区分大豆胰蛋白酶抑制因子的种类。近年来，利用特异性抗体建立起来的免疫检测方法在准确性、特异性、稳定性、适用范围以及检测效率、费用等方面都具有一定的优势，能够用于特定大豆胰蛋白酶抑制因子的检测，已成为快速检测方法研究的主要趋势，具有良好的发展前景。免疫检测方法研究的关键在于抗体的制备，目前所开发的胰蛋白酶抑制因子免疫检测方法多数利用的是多克隆抗体，而单克隆抗体的亲和力和特异性都优于多克隆抗体，所以大豆胰蛋白酶抑制因子单克隆抗体的研制将是今后免疫检测方法研究的一个关键内容。此外，目前免疫检测研究多集中在KTI 的检测方面，而针对其他类型的大豆胰蛋白酶抑制因子的检测研究仍相对缺乏，因此建立全面、特异、高效的免疫检测方法来快速监测大豆及其制品中各类胰蛋白酶抑制因子含量显得尤为必要。